劉向楠，劉助紅，劉賢旭，田存鋒，康艷梅，劉國乾，李桂珍

（廣東科貿職業(yè)學院 廣州 510430）

《動物疫病防控》是一門綜合應用性學科，具有較強的實踐性和應用性。實驗教學是《動物疫病防控》教學過程中的一個重要的必須環(huán)節(jié)，通過基本方法和技能培訓，培養(yǎng)學生理論聯(lián)系實際、發(fā)現問題及解決問題的綜合能力。目前我國農業(yè)院校開設的《動物疫病防控》課程中在疫病實驗室診斷方法部分普遍存在教學內容相對陳舊，實驗內容落后等問題。例如，經典的細菌培養(yǎng)或病毒分離方法耗時長，主要適用于科研型實驗室；熒光定量PCR等分子生物學檢測方法近年來迅速發(fā)展和應用，但對儀器設備要求較高，在基層推廣較為困難。為了學生能更好地學習《動物疫病防控》課程，從業(yè)后滿足就業(yè)崗位的實際需要，本教學團隊將環(huán)介導等溫擴增（loop-mediatediso the rmalam plification，LAMP）技術添加到實訓課程教學中，與學生共同探討了該方法的技術優(yōu)勢及在臨床應用的價值，得到了較好的效果。

LAMP技術是一種新型核酸擴增技術，其原理是采用4或6條能夠識別目的基因上的6個特異區(qū)域的引物，依賴與Bst DNA聚合酶的強鏈置換活性，在65℃等溫條件下30min就能擴增出約109～1010拷貝的靶序列。試劑盒內配備變色反應指示劑，可根據顏色變化判定實驗結果。LAMP技術對核酸質量要求不高，可配合核酸免提取技術使用，現場即可完成檢測，耗時短，無需昂貴儀器設備。目前，基于LAMP檢測方法建立的非洲豬瘟檢測試劑盒已獲得新獸藥證書，在獸醫(yī)臨床中得到廣泛應用。故將環(huán)介導等溫擴增技術應用到《動物疫病防控》能夠讓學生了解一線動物疫病實驗室診斷新方法，為學生畢業(yè)后走向工作崗位打下一定的基礎。

1 目前《動物疫病防控》課程教學過程中采用的實驗室診斷方法

1.1 聚合酶鏈式反應法（PCR）

該方法是目前教學和實踐中均廣泛使用的方法。PCR方法發(fā)明至今已有將近30年的歷史，技術非常成熟、配套試劑價格低廉、儀器設備價格也逐年降低，是實驗室檢測的主流方法之一，已具有替代傳統(tǒng)分離鑒定法的趨勢。但該方法在完成擴增程序后需要進行凝膠電泳，這一過程費時費力且在開蓋過程中極易造成氣溶膠污染，因此在臨床一線實驗室較少應用。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

ELISA是免疫學診斷中常用的檢測技術，已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病檢測。本方法具有靈敏度高、特異性好、操作較為簡單的特點，由于1d內可以同時檢測幾百上千份標本，因此在大型養(yǎng)殖企業(yè)中主要使用該技術方法評估疫苗免疫后的抗體水平。但是商品化的ELISA試劑盒主要以進口產品為主，成本較高，并且檢測依賴于實驗室，無法應用于現場檢測。

1.3 血凝、血凝抑制實驗（HA、HI）

血凝實驗及血凝抑制實驗是檢測新城疫、禽流感等禽傳染病的常用方法，也是檢測家禽免疫抗體水平的常用方法。因其操作簡便、快速、經濟、無需儀器設備和可以對抗體水平進行量化的優(yōu)點被廣泛應用于基層飼養(yǎng)場。但該方法僅應用于特定的病原，絕大多數疫病不適用，1%紅細胞懸液的制備需要新鮮配制和保存，結果判讀主觀性較強。

1.4 瓊脂擴散實驗

瓊脂擴散實驗主要原理是利用擴散原理，將可溶性抗原與抗體分別加入在半固體瓊脂孔內，緩慢擴散，當抗原與抗體對應且比例適宜則形成白色沉淀線為陽性結果，否則為陰性結果。此方法非常經典，目前仍應用于馬立克氏病等傳染病檢測。其缺點是需要過夜反應，耗時長，靈敏度欠佳。

2 LAMP檢測方法的教學應用

在畜牧獸醫(yī)領域LAMP技術最早大規(guī)模應用于水產病原微生物檢測，未引起足夠重視。伴隨著基于LAMP技術的非洲豬瘟病毒檢測試劑盒獲得農業(yè)部的新獸藥證書并在基層得到大量使用，LAMP技術已被普遍接受和認可。為了適應技術進步，緊跟發(fā)展趨勢，作為畜牧獸醫(yī)相關專業(yè)的學生有必要了解LAMP技術。

2.1 基本內容

本課程以實踐應用為導向，教師結合案例帶領學生分析豬塞內加谷病的流行病學特征、臨床癥狀、病理變化以及設計LAMP方法的方案。

2.2 實驗目的

①了解豬塞內加谷病毒的流行情況、致病性和預防措施；②掌握環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術的原理及操作方法；③建立豬塞內加谷病毒環(huán)介導等溫擴增（LAMP）檢測方法。

2.3 實驗原理

環(huán)介導等溫擴增技術利用識別多區(qū)域特異性引物組和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右等溫條件下30min即可擴增109～1010拷貝的靶序列。在反應體系中加入指示劑，可裸眼觀察判斷結果。

2.4 試劑與儀器

2×Lamp Master Mix購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；豬塞內加谷滅活病毒由廣東省實驗動物監(jiān)測所提供；金屬浴購自大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份有限公司。

2.5 實驗方法

以豬塞內加谷病毒作為檢測對象。

序列查找和引物設計：從Genbank上查找并下載豬塞內加谷滅活病毒VP1基因序列，將序列遞交到在線網站http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.htm l自動生成多個LAMP引物組合，評分最高的引物序列委托上海生工合成。

核酸提?。喊碦NA提取試劑盒說明書提取滅活病毒中的RNA，測定RNA濃度和純度。

按以下組分配置反應混合液，轉入0.2mLPCR管中：

2×HNB Iso Amp Mix 12.5μL；

10×LAMPPrimerMix 2.5μL；

5M Beta in 2μL；

模板DNA 1μL；

Bst 2.0DNA Polymerase 1μL；

dd H2O補充至25μL。

Bst 2.0DNA Po lymerase 1μL；dd H2O補充至25μL。

將配置好的反應液充分混勻并瞬時離心，置于65℃金屬浴中，30min后觀察顏色變化。若擴增樣本為陽性則由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{色（圖1）。

圖1 豬塞內加谷病毒LAMP檢測結果

2.6 實驗教學效果

本實驗內容涉及的病原為新發(fā)傳染病，一般教材中未涉及該病原，需要老師課前與學生查閱相關參考文獻了解豬塞內加谷病毒的背景信息。實操過程中按4～6人每組進行分組，鼓勵組內分工協(xié)作，共同完成整個實驗過程，組間進行平行實驗來驗證LAMP技術的穩(wěn)定性。在結果判讀結束后，教師提供非洲豬瘟、藍耳病、偽狂犬等其他病原序列，供學生進一步演練引物設計環(huán)節(jié)。最終通過組內匯總分析實驗結果完成實驗報告。

本次從畜牧獸醫(yī)行業(yè)實際需求出發(fā)，理論與實踐相結合。在課前要求學生查閱文獻資料了解豬塞內加谷病毒和LAMP技術相關知識，由學生自主設計引物鍛煉了學生分析問題、解決問題的能力。在實驗過程中，進一步鞏固了核酸提取、反應體系配制等分子生物學相關技能，提高了學生的動手能力和團隊協(xié)作能力。在課后的案例分析中，引導學生對臨床案例進行分析討論，舉一反三，強化了科學分析能力并增強了學生自主學習的積極性。為后續(xù)專業(yè)課程的學習及日后就業(yè)打下了堅實的基礎。

3 結語

目前《動物疫病防控》實訓內容中的疫病實驗室診斷側重于PCR方法、ELISA法和HA/HI實驗進行動物疫病診斷，而臨床上已經出現了一些新檢測技術，LAMP技術在臨床應用廣泛，將其應用于《動物疫病防控》課程，可以為學生提供一個相對真實的動物疫病診斷環(huán)境，將理論和實踐結合起來，對學生的應變能力和技能熟練度要求較高，提高實踐動手能力，在實驗中考察學生檢測技能，從而提高學生的學習效率和教習效果。█