賀燕，王益軍，張?zhí)K珍，葛敏，譚海榮

（連云港市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 江蘇連云港 222001）

呋喃唑酮又稱痢特靈，是人工合成的廣譜抗菌藥物，屬硝基呋喃類藥物，它有非常好的抗菌效果和藥代動力學(xué)的特性[1]，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，它還可以作為豬、禽類和水產(chǎn)促生長的添加劑。但在長時間的實驗室研究過程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類的藥物和代謝物均可使實驗動物發(fā)生癌變和基因突變，因此，此類藥物禁止在治療和飼料中使用[2]。自1993年起，歐盟范圍內(nèi)便禁止在動物飼養(yǎng)中使用硝基呋喃類藥物鹽酸呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，而呋喃唑酮也從1995年起被禁用。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中也規(guī)定動物性食品中呋喃唑酮檢出限為不得檢出[3]。

硝基呋喃類藥物在體內(nèi)迅速代謝，在組織中與細胞膜蛋白結(jié)合長期持續(xù)存留，因此在分析此類藥物的殘留時以分析代謝物為主[4]。目前，動物組織中呋喃唑酮代謝物（AOZ）殘留分析主要采用高效液相色譜法（HPLC-MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和酶聯(lián)免疫法（ELISA)。前者由于需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、繁瑣的前處理過程及對檢驗人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查，而以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，已在農(nóng)獸藥殘留檢測中得到廣泛應(yīng)用[1]。本文利用酶聯(lián)免疫方法對禽蛋中AOZ的殘留量進行檢測，為禽蛋中呋喃唑酮類藥物殘留監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禽蛋市場隨機采樣。

呋喃唑酮代謝物（AOZ）ELISA檢測試劑盒（包括包被有偶聯(lián)抗原的96孔酶標板），質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100、200、400ng/L的AOZ標準液，酶連接物，抗體液，底物/發(fā)色劑溶液，反應(yīng)終止液，洗滌緩沖液（鹽），2-硝基苯甲醛購自德國拜發(fā)公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

勻漿機（九陽JYL-C 16V）；電子天平（德國賽多利斯）；數(shù)顯振蕩搖床（德國IKA）；恒溫培養(yǎng)箱（上海博泰）；漩渦混合器（德國IKA，MS3 basic）；高速冷凍離心機（德國sigma）；氮吹儀（美國Organomation）；微量移液器（單道20～200μL、200～1,000μL，多道50～300μL）；微孔板酶標儀（賽默飛Mu ltiskan FC 450nm）；超高效液相三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

1.3 試劑配制

1mol/LHC l溶液：量取90mLHC l，緩慢注入910mL水中；10mmol/L2-硝基苯甲醛：7.6mg 2-硝基苯甲醛溶于5mL二甲基亞砜；0.1mol/LK2HPO4：準確稱取14.6g K2HPO4溶于1,000mL水；1mol/LNaOH：準確稱取40g NaOH溶于1,000mL水。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理稱取（1.00±0.05g）勻漿后的樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入3.9mL蒸餾水，0.5mL 1mol/L的HC l和200μL 10mmol/L 2-硝基苯甲醛振蕩混合；50℃條件下孵育3h或者37℃條件下隔夜（約16h）孵育；加入5mL 0.1mol/LK2HPO4，0.4mL 1mol/LNaOH和5mL乙酸乙酯，振蕩混合30s（樣品加熱至最多50℃，以獲得更好的分層效果）；離心10min/3000g/室溫（20～25℃）；取2.5mL乙酸乙酯層（上層）溶液加入到新的容器中（樣品濃度過高時，要適當減少乙酸乙酯的取樣量），蒸干，干燥物用1mL正己烷溶解，加入1mL樣品緩沖液徹底混合；然后離心10min/3000g/室溫（20～25℃）；取50μL下層水相進行檢測。

1.4.2 檢測原理檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對AOZ抗體的捕獲抗體。加入標準品、樣品溶液、AOZ酶連接物及AOZ抗體，游離的AOZ與AOZ酶連接物競爭AOZ抗體結(jié)合位點（競爭性酶免疫分析）。同時AOZ抗體也與微孔板上固定的捕獲抗體結(jié)合，沒有結(jié)合的AOZ酶連接物在洗滌步驟中被除去。將底物/發(fā)色劑加入到孔中并且孵育，結(jié)合的酶連接物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在450nm處測量。吸光度值與樣品中的AOZ濃度呈反比。

1.4.3 ELISA檢測步驟使用之前將所有試劑回溫至室溫（20～25℃）；將足夠標準品和樣品檢測所需數(shù)量的孔條插入微孔板架，均做兩個平行實驗，記錄下標準品和樣品的位置；加入50μL標準品或處理好的樣品溶液到相應(yīng)的微孔中，不同樣品或標準品的添加換用新的移液頭；加入50μL酶連接物溶液，再加入50μL抗體溶液，輕輕振蕩充分混合，置20～25℃避光環(huán)境下孵育1h；倒出孔內(nèi)液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，加入250μL洗滌緩沖液，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；加入100μL底物/發(fā)色劑，輕輕振蕩充分混合，置20～25℃避光環(huán)境下孵育15min；加入反應(yīng)終止液100μL，輕輕振蕩充分混合，于450nm處測量吸光度（在加入反應(yīng)終止液后30min內(nèi)讀數(shù)）。

1.4.4 標準曲線的建立使用R-BiopHa rm德國拜發(fā)公司專門為RIDASCREEN系列產(chǎn)品設(shè)計的應(yīng)用軟件來進行結(jié)果分析。對單次檢測建議使用Log it/log曲線進行結(jié)果分析，對兩次或多次平行檢測應(yīng)該使用Cub ic Sp line曲線進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA標準曲線

按照酶聯(lián)免疫分析步驟，分別測定濃度為0、25、50、100、200、400ng/LAOZ標準液的吸光度值，采用RIDASCREEN數(shù)據(jù)分析軟件建立標準曲線如圖1。

圖1 RIDASCREEN數(shù)據(jù)分析軟件建立標準曲線

2.2 精密度和準確度

取空白雞蛋樣本，以0.2、0.4、0.6μg/kg 3個添加量的AOZ對其進行添加回收試驗，ELISA法測定的準確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示，每個添加量做5個平行，結(jié)果見表1。

由表1可知，以0.2、0.4、0.6μg/kg 3個添加量的AOZ對空白雞蛋進行添加，其加標回收率為77.7%～101.8%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.4%～7.0%。

表1 試劑盒的準確度和精密度實驗（n=3）

2.3 檢測限

對20份空白樣品進行檢測，從標準曲線上得出樣品質(zhì)量濃度，以20份樣品AOZ質(zhì)量濃度的平均值（X ）和標準差（s）表示檢測限（MDL），即MDL=X +3s，該方法對雞蛋樣品的檢測限為0.1μg/kg。

2.4 方法特異性

試劑盒特異性由交叉反應(yīng)率表示。由表2可知，該試劑盒與AOZ原藥有一定的交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率為1.2%，這可能是因為AOZ與其原藥有類似的結(jié)構(gòu)，而對其他呋喃類藥物及其代謝物的交叉反應(yīng)率均較低，表明本試劑盒具有良好的特異性。

表2 試劑盒特異性試驗

2.5 ELISA法與LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較

利用ELISA和LC-MS/MS對20份（分別編號01～20）禽蛋樣品進行測定，結(jié)果見表3，用ELISA法檢測，陰性樣品18份，陽性樣品2份（含量大于0.5μg/kg），相同樣品經(jīng)LC-MS/MS方法（農(nóng)業(yè)部781號公告-4-2006動物源食品中硝基呋喃類代謝物（AOZ）殘留量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）測定后，18份陰性樣品均為陰性，2份陽性樣品均為陽性，陰、陽性判斷結(jié)果一致。比較結(jié)果見表3。

由表3可知，用ELISA法與LC-MS/MS法的測定結(jié)果相符，沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性樣品，ELISA法適用于禽蛋中AOZ殘留量檢測的篩選。

表3 ELISA法與LC-MS/MS法檢測結(jié)果比較

3 討論

3.1 樣品的衍生化與前處理

在AOZ的檢測中，一般先加入衍生化試劑進行衍生。這主要是由于AOZ的分子量較小，不易被檢測。而在37℃或50℃酸性條件下，加入衍生化試劑2-硝基苯甲醛（使用前必須新鮮配制），形成衍生產(chǎn)物2-NP-AOZ，分子量增大，大大提高了檢測靈敏度。目前采用的有常規(guī)衍生化方法，即在37℃孵育過夜，37℃孵育過夜至少16h，導(dǎo)致衍生化過程是整個樣本處理的限速環(huán)節(jié)；高溫短時間方法，即在50℃孵育3h，可縮短樣本處理時間。加入乙酸乙酯后振蕩不能過于激烈且時間不宜過長，否則容易乳化，影響樣品分層。

3.2 稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響

運用酶聯(lián)免疫法檢出超過曲線最高點的陽性樣品，這時得到的數(shù)據(jù)往往不準確，只能起到定性的作用，為提高檢測結(jié)果準確性，根據(jù)所得吸光度值判斷需要稀釋倍數(shù)，稀釋后重新測定。

由表4可知，超出曲線最高點的陽性樣品，可通過減少提取液乙酸乙酯的量，增大樣品稀釋倍數(shù)，或者直接稀釋樣品檢測液，保證稀釋后的檢測濃度在標準曲線范圍內(nèi)，才能得到相對準確的檢測結(jié)果。

表4 不同稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響

3.3 方法應(yīng)用前景

運用酶聯(lián)免疫法對禽蛋中AOZ殘留進行篩選，能在短時間內(nèi)檢測幾十到上百個樣品，且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣品前處理簡單，檢測成本低，是藥物殘留檢測發(fā)展的趨勢，但目前篩選法的檢測標準極少，檢測限（即陽性濃度標準）不統(tǒng)一，給檢測結(jié)果判定帶來一定困難，對篩選可疑結(jié)果需用確證方法進行確證。酶聯(lián)免疫法作為一種快速篩選手段，在現(xiàn)場監(jiān)控和基層檢測中有著廣闊的推廣應(yīng)用前景[5]。

4 小結(jié)

通過酶聯(lián)免疫法對禽蛋中AOZ殘留進行檢測，測定結(jié)果準確，樣品的最低檢測限為0.1μg/kg，當添加0.2、0.4、0.6μg/kg時，加標回收率為77.7%～101.8%，變異系數(shù)為0.4%～7.0%。陽性樣品經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法確證，檢測結(jié)果相符，沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性樣品。酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測靈敏度和定量線性范圍均達到檢測限量要求，且樣本前處理操作快速簡單、檢測成本低、儀器設(shè)備投資少，適合于大量樣本中AOZ殘留量檢測的快速篩選。█