莫茜，陽愛國，郝力力，李春隆，袁東波，楊天俊，李盛瓊，尹杰，高露，侯巍

（1.四川省動物疫病預防控制中心 成都 610041；2.西南民族大學生命科學與技術學院 預防獸醫(yī)系成都 610041；3.儀隴縣畜牧站 四川南充 637000；4.富順縣水產(chǎn)漁政服務中心 四川自貢 643000）

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是由布魯氏菌屬細菌侵入機體引起的一種人畜共患傳染病，動物感染布病主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、睪丸炎、附睪炎等[1]，造成生產(chǎn)性能和繁殖機能的下降；全球有170多個國家和地區(qū)都報告過布病病例[2]，每年報告約50萬人感染布病[3]，造成巨大的經(jīng)濟損失和社會公共衛(wèi)生問題。我國將其列為乙類傳染病、二類動物疫病。自21世紀以來，隨著畜牧業(yè)發(fā)展，動物流動性增加等原因，我國牛羊布病感染狀況總體呈上升趨勢，近年來，全國動物疫控系統(tǒng)通過不斷推進布病防治、監(jiān)測和凈化，取得了一定的成效。但受動物流動性大、基層防疫體系薄弱、淘汰病畜難度大、防治經(jīng)費投入不足等因素影響，我國布病防控形勢依然十分嚴峻。

布病的實驗室診斷方法包括病原學方法和血清學方法。由于病原分離耗時長，對實驗室生物安全級別要求高、存在風險等原因，因此并不常用；血清學診斷方法操作簡單、適用性廣，包括虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、熒光偏振測試（FPA）、膠體金免疫層析法（G ICA）[4]等。SAT法優(yōu)點是價格便宜，可以定量測定抗體水平，具有較高的特異性，因此多用于布病檢測的復核確認[5]。ELISA法操作方便，靈敏度高，一次可以完成大量樣品的檢測，在2018年納入我國法定布病檢測方法。c ELISA不僅可以檢測交叉感染，還可以鑒別疫苗接種和野毒株感染[6]。膠體金免疫層析技術具有快速檢測的特點，不需要配置儀器，但需要通過肉眼判定結果，敏感度不夠高，存在假陽性和假陰性，比較適合于流行病學調查及野外現(xiàn)場檢測[7]。

為檢測對比各種試劑的有效性，確保布病檢測結果準確，減少漏診和誤診情況，本研究對3種布病血清學檢測方法進行了比對試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測試劑布魯氏菌病試管凝集試驗抗原，購自中監(jiān)所，批號20191030，布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒，購自青島立見診斷技術發(fā)展中心，批號020162004，布魯氏桿菌抗體高敏熒光檢測試劑盒，購自成都微瑞生物有限公司，批號BRB20102116379。

1.1.2 血清樣本血清樣本為筆者所在中心保存的已知感染情況的牛羊血清，其中牛血清樣本92份，羊血清樣本92份。

1.1.3 設備與耗材96孔酶標儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；37℃恒溫箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司產(chǎn)品；精確的單道微量移液器和多道微量移液器，Transfe rpe tte公司產(chǎn)品；一次性移液器吸頭：Axygen公司產(chǎn)品；高敏熒光分析儀，Wellra y?WR-1808。

1.2 方法

實驗方法：試管凝集試驗按照GB/T18646—2018進行操作與判定，酶聯(lián)免疫吸附試驗、高敏熒光免疫分析試驗按試劑操作說明書進行操作和結果判定。

數(shù)據(jù)處理方法：對檢測數(shù)據(jù)采用Excel處理，用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用假陽性率、假陰性率、一致率和Ka p pa值四種分析指標。

假陽性率與實驗的特異性有關，即在金標準判斷為陰性樣本中，檢測出為陽性的幾率。假陰性率與實驗的敏感性有關，即在金標準判斷為陽性樣本中，檢測出為陰性的幾率。一致率是檢測方法的相關程度，指確診的陽性與陰性樣本且與兩種檢測方法結果相一致的總和與所有檢測樣本的百分比；Kappa值是醫(yī)學上常用的一種用于計數(shù)資料的一致性評測，是評價一致性的測量值。一般認為，Kappa≥0.75，說明兩種方法診斷結果一致性較好；0.4≤Kappa＜0.75，說明兩種方法診斷結果一致性一般；Kappa＜0.4，說明兩種方法診斷結果一致性較差。

2 結果與分析

2.1 牛不同布魯氏菌病血清學檢測試劑結果

采用試管凝集方法、競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法對92份已知感染情況的牛血清（其中47份為真正感染的陽性血清，45份未感染的陰性血清）進行檢測，比較它們的敏感性和特異性。結果見表1。

表1 3種布病血清學檢測方法牛血清檢測結果比較

結果表明競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法Kappa值大于75%，試管凝集方法Kappa值小于75%，說明競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法檢測結果一致性較好，試管凝集方法一致性一般。試管凝集法的假陰性數(shù)最高，為12個，假陰性率為25.53%，高敏熒光檢測方法假陽性數(shù)最高，為2個，假陽性率為4.44%。實驗結果表明敏感性最高的是競爭ELISA方法，特異性最高的是試管凝集方法。

2.2 羊不同布魯氏菌病血清學檢測試劑結果

采用試管凝集方法、競爭ELISA方法、高敏熒光檢測方法對92份已知感染情況的羊血清（其中13份為真正感染的陽性血清，79份未感染的陰性血清）進行檢測，比較它們的敏感性和特異性。結果見表2。

表2 3種布病血清學檢測方法羊血清檢測結果比較

結果表明3種檢測方法Kap pa值大于75%，說明3種檢測方法檢測結果一致性較好。試管凝集法和競爭ELISA方法的假陰性率均為7.69%，競爭ELISA方法和高敏熒光檢測方法的假陽性率為1.27%。實驗結果表明敏感性最高的是高敏熒光檢測方法，特異性最高的是試管凝集方法。

2.3 分析與討論

動物感染布病后癥狀不明顯，通過臨床診斷來確定動物是否患有布病就顯得相對困難。血清學診斷方法由于操作簡單、適用性廣，是目前國內(nèi)最常規(guī)的使用方法。本研究通過對3種布病血清學檢測方法進行對比分析，以便為當前布病血清學診斷方法提供參考。

試驗檢測結果中假陽性率越高，說明容易出現(xiàn)陰性動物誤診的情況，造成撲殺動物不必要的經(jīng)濟損失；假陰性率越高，說明容易出現(xiàn)陽性動物漏檢的情況，造成病原擴散，不利于養(yǎng)殖場或地區(qū)布病的凈化工作。試管凝集法具有較高的特異性，成本低廉，是我國布病常用的確診方法。但其敏感性相對較低，易出現(xiàn)漏診的情況，且操作時間長，檢測結果判定以人肉眼為主，易受人主觀影響[8]。競爭ELISA法為我國現(xiàn)行國標推薦方法，本次比對試驗結果顯示一致性、假陽性率和假陰性率均有較優(yōu)表現(xiàn)，操作簡便，可適用于批量化大規(guī)模檢測，在布病的檢測中有良好的應用價值。膠體金免疫層析法在通常采用肉眼判斷易造成人為誤差，本研究中的高敏熒光檢測方法采用熒光儀讀數(shù)，避免了人為因素的干擾，在比對結果中也表現(xiàn)出了較好的一致性、假陽性率和假陰性率，操作簡便，反應時間短，儀器簡易可攜帶，適用于基層大規(guī)模檢測。█