馬 赟,胡海濤,趙炳武,陳志強(qiáng)

(1. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011；2. 邢臺(tái)市第九醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 055250)

膜性腎病是以無(wú)癥狀蛋白尿或腎病綜合征為主要臨床表現(xiàn)、腎小球基底膜彌漫增厚伴上皮細(xì)胞下免疫復(fù)合物沉積為病理特征的一組疾病，近些年其發(fā)病率明顯升高[1]。膜性腎病自然病程差別較大，30%～40%的患者可在起病5～10年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]。目前膜性腎病尚無(wú)公認(rèn)療效滿意的治療方案，高危患者主要依靠糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑使病情緩解，但藥物相關(guān)的不良反應(yīng)可能對(duì)患者造成嚴(yán)重?fù)p害。因此，積極尋找有效且安全的替代治療方案具有十分重要的意義。近年來(lái)多項(xiàng)臨床研究證明中醫(yī)藥治療膜性腎病效果確切[3-4]，但在機(jī)制方面尚無(wú)重大突破。本研究通過(guò)觀察宣通三焦、活血通絡(luò)方對(duì)膜性腎病大鼠24 h尿蛋白定量(24hUTP)、血白蛋白(ALB)、血脂、腎功能及腎臟病理形態(tài)學(xué)和腎組織中Nephrin、NEPH1 mRNA表達(dá)的影響，探討了宣通三焦、活血通絡(luò)方對(duì)膜性腎病的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重(170±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證書(shū)編號(hào)：1604114。大鼠分籠普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，溫度控制在25 ℃左右，濕度控制在70%左右。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 宣通三焦、活血通絡(luò)方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，處方組成：黃芪(2.0 g/袋，批號(hào)：5122421，相當(dāng)于飲片10 g)、桂枝(0.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5122631，相當(dāng)于飲片6 g)、仙靈脾(0.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5073301，相當(dāng)于飲片10 g)、當(dāng)歸(3.0 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：6010751，相當(dāng)于飲片10 g)、川芎(1.3 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5124691，相當(dāng)于飲片6 g)、丹參(1.8 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5122141，相當(dāng)于飲片10 g)、紅花(0.8 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5111131，相當(dāng)于飲片5 g)、地龍(1.0 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5112581，相當(dāng)于飲片10 g)、水蛭(1.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：504441T，相當(dāng)于飲片3 g)、藿香(0.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5083321，相當(dāng)于飲片10 g)、白豆蔻(0.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5082941，相當(dāng)于飲片6 g)、積雪草(1.4 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5072761，相當(dāng)于飲片15 g)、澤瀉(1.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5112541，相當(dāng)于飲片10 g)、炒白術(shù)(3.0 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：5113321，相當(dāng)于飲片10 g)、茯苓(0.5 g/袋，產(chǎn)品批號(hào)：6010801，相當(dāng)于飲片10 g)。雷公藤多苷片，湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，10 mg/片，產(chǎn)品批號(hào)：20151202；醋酸潑尼松片，浙江仙琚制藥股份有限公司，5 mg/片，產(chǎn)品批號(hào)：160206。

1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑 牛血清白蛋白、碳化二亞胺、弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)；無(wú)水乙二胺(美國(guó)阿法埃莎化學(xué)有限公司)；總蛋白測(cè)定試劑盒(雙縮脲終點(diǎn)法)、白蛋白試劑盒(溴甲酚綠法)、總膽固醇(TC)試劑盒(酶比色法)、三酰甘油(TG)試劑盒(酶比色法)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)測(cè)定試劑盒(北京金豪制藥有限公司)；TRIzol總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus), ROX plus、DL2,000 DNA Marker(TaKaRa)。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器 透析袋(北京索萊寶科技有限公司)；BECKMAN CX7全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)；712型尿蛋白(24 h)分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；MICROM-340E石蠟切片機(jī)(德國(guó)Zeiss公司)；H-7650 型透射電子顯微鏡(日本HITACHI株式會(huì)社)；病理圖像分析儀(北京航空航天大學(xué)圖像中心)；高速低溫離心機(jī)(美國(guó)SIGMA公司)；超低溫冰箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)；PCR PX2 Thermal Cycler、ND-1000核酸定量?jī)x(美國(guó)Thermo公司)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；凝膠成像分析系統(tǒng)(南京捷達(dá)公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 40只大鼠以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，留取24 h尿液，測(cè)其尿蛋白定量均為陰性。隨機(jī)選取10只大鼠作為正常組，其余大鼠進(jìn)行造模。參照改良Border法制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(C-BSA)，在造模大鼠的背部、雙側(cè)腹股溝及腋下多點(diǎn)皮下注射C-BSA混懸液(C-BSA 1 mg加入0.5 mL PBS中，再和等量的弗氏不完全佐劑相混勻)進(jìn)行預(yù)免疫，隔日1次，共3次。預(yù)免疫1周后，每只大鼠隔日1次尾靜脈注射C-BSA (16 mg/kg)，連續(xù)注射4周。以大鼠24 hUTP≥20 mg為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為膜性腎病組、雷公藤+激素組、中藥組，每組10只。正常組、膜性腎病組給予生理鹽水3 mL/只灌胃，雷公藤+激素組給予雷公藤多苷片和醋酸潑尼松片混懸液[參照文獻(xiàn)[5]方法，將雷公藤多苷片5.4 mg/(kg·d)加醋酸潑尼松片0.9 mg/(kg·d)溶于3 mL的蒸餾水中配成混懸液]灌胃，中藥組給予宣通三焦、活血通絡(luò)方混懸液(根據(jù)體表面積換算公式[6]計(jì)算中藥用量：黃芪2.7 g/kg、桂枝0.9 g/kg、仙靈脾1.35 g/kg、當(dāng)歸1.35 g/kg、紅花0.9 g/kg、川芎1.08 g/kg、丹參1.35 g/kg、地龍1.35 g/kg、水蛭0.54 g/kg、藿香0.9 g/kg、白豆蔻0.9 g/kg、積雪草2.7 g/kg、澤瀉1.35 g/kg、炒白術(shù)1.35 g/kg、茯苓1.35 g/kg，溶于3 mL的蒸餾水中配成混懸液)灌胃,均1次/d，連續(xù)用藥4周。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.124hUTP測(cè)定 灌胃結(jié)束后各組大鼠分別用代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，離心后取上清液，采用雙縮脲法測(cè)定24hUTP。

1.6.2血液生化指標(biāo)檢測(cè) 灌胃結(jié)束后各組大鼠禁食水12 h，10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清，用BECKMAN CX7 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠ALB、SCr、BUN、TC及TG。

1.6.3腎臟病理形態(tài)觀察 ①光鏡觀察：取部分腎皮質(zhì)用10%的多聚甲醛溶液固定，以酒精梯度逐級(jí)脫水，石蠟包埋制成2 μm的切片后，行PAS、HE染色，觀察大鼠腎小球及腎間質(zhì)情況，拍照記錄。②電鏡觀察：取約米粒大小的腎皮質(zhì)，立刻放入預(yù)冷的4%戊二醛固定液中，固定1 h，用PBS液充分清洗，再放入已經(jīng)預(yù)冷的1%鋨酸中固定2 h，PBS液充分清洗，用酒精梯度逐級(jí)脫水，100%丙酮脫水2次，在丙酮和樹(shù)脂混合液中浸泡15 min，純樹(shù)脂中浸泡30 min，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色，電鏡下觀察，并采集圖像。③免疫熒光觀察：取新鮮腎皮質(zhì)制作成冰凍切片，厚約5 μm；經(jīng)冷丙酮固定8～10 min，晾干后用PBS沖洗3 min，3次；滴加5 μL一抗(1∶50)，放置濕盒內(nèi)，37 ℃孵育1 h，PBS液連續(xù)沖洗3 min，3次；滴加5 μL FITC標(biāo)記二抗(1∶50)，放置濕盒內(nèi)，于37 ℃孵育30 min，PBS連續(xù)沖洗3 min，3次；緩沖甘油(pH值9.0)封片鏡檢，并拍照記錄。顯微鏡下顯示的熒光強(qiáng)度可分為5級(jí),0級(jí)：無(wú)熒光；1+：低倍鏡不可見(jiàn)，高倍鏡可見(jiàn)；2+：低倍鏡可見(jiàn)，高倍鏡清晰；3+：低倍鏡清晰可見(jiàn)，高倍鏡耀眼；4+：低倍、高倍鏡均十分強(qiáng)烈耀眼。

1.6.4腎皮質(zhì)中Nephrin 和NEPH1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用TRIzol總RNA提取試劑按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本RNA提取，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：GAPDH(270bp)上游為5’-AACCCTAAGGCCAACCGTAAAAG-3’，下游為5’-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3’；nephrin(132bp)上游為5’-CCAGGACTATGCCCTCTTCAA-3’，下游為5’-GAGTGAGGGCTTATGCTGACAAC-3’；Neph1(175bp)上游為5’-GGGTTCCTGATTGAAGACGC-3’，下游為5’-TGGTTGTGGGCTTTGGGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；40個(gè)PCR循環(huán)[95 ℃，5 s；60 ℃，40 s(收集熒光)]。融解曲線條件：95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，求出目的基因mRNA相對(duì)含量。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)分析使用相對(duì)定量中常用的ΔΔCq法。最終計(jì)算公式：相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCq,ΔCq=目的基因Cq平均值-內(nèi)參Cq平均值,ΔΔCq=實(shí)驗(yàn)組ΔCq-對(duì)照組ΔCq。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 正常組大鼠活動(dòng)正常，精神飲食較好；膜性腎病組大鼠造模后出現(xiàn)不同程度精神萎靡，飲食減少，形體消瘦，毛發(fā)脫落，反應(yīng)遲鈍，喜靜惡動(dòng)，大便稀溏，小便量少等癥狀，部分大鼠出現(xiàn)陰囊水腫、腹部腫大、尾部潰爛壞疽；雷公藤+激素組、中藥組大鼠上述各種情況均較膜性腎病組輕。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共死亡4只大鼠，其中膜性腎病組死亡2只，雷公藤+激素組、中藥組各死亡1只，可能與藥物過(guò)敏及尾部潰爛感染有關(guān)。

2.2各組大鼠24hUTP及血清生化指標(biāo)比較 膜性腎病組、雷公藤+激素組、中藥組大鼠24hUTP和血清TC、TG水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，血清ALB水平均明顯低于正常組(P均<0.05)；雷公藤+激素組、中藥組大鼠24hUTP和血清TC、TG水平均明顯低于膜性腎病組(P均<0.05)，血清ALB水平均明顯高于膜性腎病組(P均<0.05)；雷公藤+激素組和中藥組大鼠24hUTP及血清ALB水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，中藥組血清TC、TG水平均明顯低于雷公藤+激素組(P均<0.05)；各組大鼠BUN、Cr水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常組和膜性腎病各組大鼠24hUTP及血清生化指標(biāo)比較

2.3各組大鼠腎臟組織光鏡下形態(tài) 正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯異常；膜性腎病組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)變化明顯，腎小球基底膜彌漫性均勻增厚，毛細(xì)血管腔狹窄，釘突形成；雷公藤+激素組和中藥組大鼠的腎小球基底膜可見(jiàn)輕度增厚，部分釘突形成。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 正常組和膜性腎病各組大鼠腎臟組織PAS染色光鏡下形態(tài)(×400)

圖2 正常組和膜性腎病各組大鼠腎臟組織HE染色光鏡下形態(tài)(×400)

2.4各組大鼠腎臟組織電鏡下形態(tài) 正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，基底膜均勻無(wú)增厚，足突排列整齊無(wú)融合；膜性腎病組大鼠腎小球上皮下致密物大量沉積，基底膜彌漫性增厚，足細(xì)胞足突彌漫融合，釘突形成；雷公藤+激素組和中藥組大鼠的病理改變明顯較膜性腎病組輕。見(jiàn)圖3。

圖3 正常組和膜性腎病各組大鼠腎臟組織電鏡下形態(tài)(×20 000)

2.5各組大鼠腎臟組織免疫熒光下表現(xiàn) 正常組大鼠熒光強(qiáng)度較弱，未見(jiàn)明顯的免疫復(fù)合物沉積；膜性腎病組大鼠免疫熒光可見(jiàn)大量IgG呈現(xiàn)顆粒狀、高強(qiáng)度沿著毛細(xì)血管襻呈彌漫性沉積；雷公藤+激素組和中藥組大鼠IgG沉積明顯較膜性腎病組少。見(jiàn)圖4。

圖4 正常組和膜性腎病各組大鼠腎臟組織免疫熒光下表現(xiàn)(×400)

2.6各組大鼠腎組織中Nephrin和NEPH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 膜性腎病組、雷公藤+激素組、中藥組大鼠腎組織中 Nephrin 和NEPH1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常組(P均<0.05)；雷公藤+激素組、中藥組大鼠腎組織中 Nephrin 和NEPH1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯高于膜性腎病組(P均<0.05)，雷公藤+激素組與中藥組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正常組和膜性腎病各組大鼠腎組織中Nephrin和NEPH1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

隨著多種足細(xì)胞靶抗原成分的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，目前認(rèn)為特發(fā)性膜性腎病是一種器官特異性自身免疫性足細(xì)胞病[7]。裂孔隔膜作為連接相鄰足細(xì)胞足突的蛋白復(fù)合體，與特發(fā)性膜性腎病蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)。研究表明，Nephrin及NEPH1均為裂孔隔膜“拉鏈”樣結(jié)構(gòu)的重要支架，可通過(guò)正式或反式鏈接嗜異性結(jié)合，形成順勢(shì)異聚體，是維持裂孔隔膜正常結(jié)構(gòu)和功能不可或缺的部分[8]。

Nephrin是一種跨膜蛋白，特異性定位于腎小球裂孔隔膜區(qū)。電鏡下顯示Nephrin分子在裂孔隔膜區(qū)兩個(gè)臨近足突之間相對(duì)延伸，對(duì)維持足細(xì)胞裂孔隔膜結(jié)構(gòu)功能完整性起到?jīng)Q定性作用。Nephrin基因突變?cè)斐傻鞍兹笔?，可?dǎo)致濾過(guò)屏障破壞從而引起大量蛋白尿。Patrakka等[9]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將小鼠Nephrin編碼基因敲除后，電鏡下示腎小球足突融合，裂孔隔膜缺乏，剛出生的小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的蛋白尿，大多數(shù)在出生后24～48 h內(nèi)死亡，充分表明Nephrin基因?qū)α芽赘裟ぐl(fā)育的重要性。Kim等[10]發(fā)現(xiàn)特發(fā)性膜性腎病患者腎小球裂孔隔膜區(qū)Nephrin mRNA的表達(dá)明顯減少，并且正常腎組織中Nephrin沿腎小球基底膜呈廣泛線性分布，而患者Nephrin mRNA則呈點(diǎn)狀分布于腎小球基底膜上，表明Nephrin與特發(fā)性膜性腎病蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)。NEPH1同樣是一種跨膜蛋白，表達(dá)部位在足突上，屬于免疫球蛋白超家族成員，可以通過(guò)MAPK的激活發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。NEPH1 mRNA的缺失可導(dǎo)致小鼠患有嚴(yán)重的先天性腎病綜合征并早期死亡[11]。秦衛(wèi)松等[12]和朱伶俐等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明雷公藤甲素可以通過(guò)上調(diào)Nephrin mRNA和NEPH1 mRNA的表達(dá)發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。

根據(jù)膜性腎病的臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)“水腫”“尿濁”等病范疇?！端貑?wèn)·水熱穴論》里提到：“腎者，胃之關(guān)也，關(guān)門(mén)不利，故聚水而從其類也。上下溢于皮膚，故為胕腫。”《素問(wèn)·至真要大論》指出“諸濕腫滿，皆屬于脾”?？梢?jiàn)本病與脾腎功能關(guān)系密切，為本虛標(biāo)實(shí)之證。本課題組結(jié)合多年臨床實(shí)踐，總結(jié)膜性腎病的基本病機(jī)為“脾腎虧虛、瘀水互結(jié)”，進(jìn)而擬定宣通三焦、活血通絡(luò)方治療本病，取得明顯療效[14-15]。方中黃芪善補(bǔ)脾益腎以治本，利尿固表以治標(biāo)，益氣行血以化瘀，固表以阻外邪；仙靈脾脾腎雙補(bǔ)，與黃芪合用，使脾腎同補(bǔ)，既固先天之本，又充后天之源；桂枝溫經(jīng)脈，助陽(yáng)氣，常配伍黃芪以益氣通陽(yáng)、化氣利水；藿香芳香化濕以宣散上焦; 陳皮、白豆蔻、白術(shù)健脾祛濕以運(yùn)化中焦；茯苓、澤瀉、積雪草清熱除濕以通利下焦；地龍清熱息風(fēng)通絡(luò)利尿，水蛭破血逐瘀而不傷新血；川芎為“血中之氣藥”，佐以丹參、紅花以活血化瘀；諸藥合用，共奏健脾益腎、祛濕通絡(luò)之功效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宣通三焦、活血通絡(luò)中藥可以降低膜性腎病大鼠尿蛋白，提高血ALB，上調(diào)腎組織中Nephrin與NEPH1 mRNA表達(dá)，其作用與雷公藤聯(lián)合小劑量激素相似；可以改善脂代謝，且作用優(yōu)于雷公藤聯(lián)合小劑量激素。提示宣通三焦、活血通絡(luò)中藥可能通過(guò)上調(diào)足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白Nephrin與NEPH1 mRNA的表達(dá)，減輕膜性腎病腎臟病理改變，發(fā)揮降低蛋白尿的作用；同時(shí)本方不依賴于血ALB升高的改善脂代謝作用，也為下一步研究血脂與濕濁血瘀證的關(guān)系提供了思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。