陳曉輝，吳澤吉，聞?wù)?/p>

(1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022)

水芫花Pemphis acidula，又名海芙蓉，海紙錢魯，原始花被亞綱，桃金娘目，千屈菜科；多為分枝小灌木，偶見(jiàn)小喬木狀。水芫花提取物富含多糖、黃酮等物質(zhì)，已被證實(shí)具有體外抗氧化[1]，抑菌[2]，抗炎[3]以及抗腫瘤[4]等多種生物學(xué)活性，其藥用及保健價(jià)值正日益受到人們的關(guān)注。

植物類多糖因其具有提取方便，低毒性，高療效等特點(diǎn)，近些年來(lái)，已經(jīng)成為了炙手可熱的課題[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，從水芫花中提取得到的多糖對(duì)不但有可以效緩解小鼠腸炎，還能夠通過(guò)清除超陽(yáng)離子自由基發(fā)揮體外抗氧化作用[8]，是一種極具潛力的活性物質(zhì)，但常規(guī)方法下提取率較低。鑒于這個(gè)問(wèn)題，本文通過(guò)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法，對(duì)水芫花多糖的微波輔助提取法進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，以期達(dá)到更高的提取率，為后續(xù)生物活性檢驗(yàn)提供支持。

1 材料與儀器

1.1 材料

水芫花樣品來(lái)源于西太平洋菲律賓海的帕勞群島，經(jīng)鑒定為水芫花屬植物水芫花的枝干。

1.2 試劑與儀器

試劑：無(wú)水乙醇(貨號(hào)：10009218)、三氯甲烷(貨號(hào)：10006818)、正丁醇(貨號(hào)：10005208)、苯酚(貨號(hào)：10015318)、硫酸(貨號(hào)：10021608)以及葡萄糖(貨號(hào)：63005518)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

儀器：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分樣篩(60 目、40 目，和發(fā)篩網(wǎng)塑膠有限公司)、冷卻水循環(huán)裝置(CA-1111，上海愛(ài)朗儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100，上海愛(ài)朗儀器有限公司)、恒溫水浴鍋(HH-S，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司)、恒溫磁力攪拌器(Feb-85-2，常州國(guó)華電器有限公司)、中藥粉碎機(jī)(103，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1600，上海美譜達(dá)儀器有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(SHB-IIIA，河南省太康科教器材廠)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 水芫花多糖的提取

水芫花枝干粉碎，60 ℃烘干，過(guò)40 目篩。精確稱取水芫花粉末1.0 g，與蒸餾水混合，并按不同微波功率、提取時(shí)間利用微波輔助提取法進(jìn)行提取。提取后抽濾，濾液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮。向溶液中加入1/5 體積的sevage 試劑(正丁醇與氯仿1：5)后室溫下磁力攪拌1 h，分層棄蛋白。將去蛋白后的上清液進(jìn)一步濃縮，加入95%的乙醇，4 ℃過(guò)夜。次日，離心去上清，得水芫花粗多糖。

2.2 多糖測(cè)定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別為0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 與0.50 μg·mL-1，蒸餾水配制。取2 mL 標(biāo)準(zhǔn)液加入試管，1 mL 5%的苯酚溶液與5 mL 硫酸快速與之混合，室溫振蕩5 min。之后，沸水浴15 min 并冷卻至室溫。490 nm 處比色測(cè)定吸光度(A)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)：吸光度(A)；橫坐標(biāo)：葡萄糖質(zhì)量濃度(c)。求取回歸方程。

2.2.2 多糖提取率的測(cè)定

適量粗多糖定容至100 mL，取2 mL 放入試管。處理方法同2.2.1。490 nm 處比色測(cè)定OD 值并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出多糖質(zhì)量濃度。提取率計(jì)算公式如下：

多糖提取率=[(c×D×V)/ M]×100%

式中：c 為樣品液OD 值對(duì)照標(biāo)曲方程所得多糖的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；D 為稀釋倍數(shù)；V 為提取液的定容體積(100 mL)；M 為水芫花粉末的質(zhì)量(1.0 g)。(每組3 個(gè)平行。)

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1 不同提取時(shí)間與提取率的關(guān)系

取7 份水芫花粉末，每份1.0 g。固定料液比1：20(水芫花：蒸餾水=g：mL)；微波功率為200 W；按提取時(shí)間為2、4、6、8、10、12 和14 min 進(jìn)行微波輔助提取，檢測(cè)OD 值并計(jì)算多糖提取率。

2.3.2 不同微波功率與提取率的關(guān)系

水芫花粉末份數(shù)、質(zhì)量與提取料液比同2.3.1，提取時(shí)間固定為8 min。按微波功率為100、150、200、250、300、350 和400 W 進(jìn)行微波輔助提取，檢測(cè)OD 值并計(jì)算多糖提取率。

2.3.3 不同料液比與多糖提取率的關(guān)系

水芫花粉末份數(shù)、質(zhì)量同2.3.1，固定微波功率為200 W；提取時(shí)間為8 min；按料液比梯度：1：5；1：10；1：20；1：30；1：35；1：40；1：45(水芫花：蒸餾水=g：mL)進(jìn)行微波輔助提取，檢測(cè)OD 值并計(jì)算多糖提取率。

2.4 最佳工藝響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定3 個(gè)考量條件參數(shù)，作為試驗(yàn)的變量，并設(shè)計(jì)3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)變量：提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、料液比(C)；響應(yīng)值：水芫花多糖提取率(Y)。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

如圖1 所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=3.943 8c+0.095 3，R2=0.992 8。其線性有效范圍為0～0.5 μg·mL-1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

3.2 提取時(shí)間與多糖提取率的關(guān)系

圖2 表明，當(dāng)提取時(shí)間低于6 min 時(shí)，提取率隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，6 min 時(shí)上升至最大值9.52%。提取時(shí)間高于6 min 時(shí)，提取率有所下降，但下降趨勢(shì)緩慢?？赡苁且?yàn)樘崛r(shí)間太長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷程度加劇，對(duì)多糖造成一定的降解。因此響應(yīng)面試驗(yàn)的提取時(shí)間0 水平點(diǎn)為6 min。

圖2 提取時(shí)間與提取率的關(guān)系Fig.2 The relationship between extraction time and extraction rate

3.3 微波功率與多糖提取率的關(guān)系

圖3 表明，當(dāng)微波功率低于300 W 時(shí)，提取率隨功率的增加而上升，300 W 時(shí)上升至最大值9.36%?？紤]到微波功率高于300 W 時(shí)，提取率雖然有所下降，但變化不大；因此響應(yīng)面試驗(yàn)的微波功率0 水平點(diǎn)為300 W。

圖3 微波功率與提取率的關(guān)系Fig.3 The relationship betweenmicrowave power and extraction rate

3.4 料液比與多糖提取率的關(guān)系

如圖4 所示，料液比低于1：35 時(shí)，提取率隨料液比的加大而上升，分析原因可能與多糖飽和有關(guān)。而當(dāng)料液比達(dá)到1：35 時(shí)，提取率上升至最大值9.03%。當(dāng)料液比高于1：35 時(shí)，提取率有所下降，但下降趨勢(shì)緩慢。通常多糖提取率與料液比大小成正相關(guān)，但微波穿透能力有限，隨溶劑的增加微波不能良好地傳遞能量破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此多糖提取率也會(huì)受到一定影響。因此響應(yīng)面試驗(yàn)的料液比0 水平點(diǎn)為1：35。

圖4 液料比與提取率的關(guān)系Fig.4 The relationship between liquid-to-solid ratio and extraction rate

3.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與分析

3.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)的確定

選取上文單因素試驗(yàn)結(jié)果中相應(yīng)的考量條件，擬定響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表1：

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表Tab.1 Response surface factor level design table

3.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1，按照Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和多糖產(chǎn)量Tab.2 Box-Behnken experiment design and polysaccharide yield

使用Design-Expert 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，建立回歸方程：Y=10.07-0.17A+0.028B-0.036C+0.041AB-0.99AC-0.61BC-1.15A2-1.75B2-1.56C2其中：Y 為提取率。

3.5.3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

由表3 可知，該回歸模型對(duì)不同試驗(yàn)間的處理差異極顯著(p＜0.000 1)，而失擬項(xiàng)不顯著(p=0.406 3＞0.05)，說(shuō)明是不確定誤差造成了殘差的產(chǎn)生，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不造成實(shí)質(zhì)性的影響。R2=0.982 4，表明該模型具有較好的擬合度，R2Adj=0.959 7 與相關(guān)系數(shù)數(shù)值偏離度不大，C.V.=3.90%，變異系數(shù)很低，這些均表示該模型具有很好的準(zhǔn)確度和真實(shí)性。由表中F 值和p 值的大小可知：提取時(shí)間最為影響對(duì)水芫花多糖的提取率，料液比和微波功率對(duì)其影響次之。

表3 響應(yīng)面法對(duì)提取率的ANOVA 分析Tab.3 ANOVA analysis of extraction rate by response surface method

多糖提取率的因素顯著率體現(xiàn)在p 值的大小上面，數(shù)據(jù)表明，A、B、C、AB 這些影響條件不體現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)的顯著影響；AC、BC、A2、B2、C2這些條件在實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)極其顯著的影響，其p 值均小于0.01。由此可知一般的線性關(guān)系不能解釋各單因素條件與水芫花多糖提取之間的關(guān)系，而是需要一種非線性的關(guān)系去解釋。根據(jù)上文分析，響應(yīng)面模型擬合度高，可以體現(xiàn)條件參數(shù)與響應(yīng)值之間的實(shí)際情況，所以上述模型可用于對(duì)微波輔助提取水芫花多糖工藝的優(yōu)化。

3.5.4 響應(yīng)面圖分析

為了更簡(jiǎn)單直白地了解各單因素條件與水芫花多糖提取率之間的交互影響，使用Design-Expert 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行并得到響應(yīng)面圖(圖5)。曲面圖中，該因素對(duì)多糖提取率影響越顯著，其坡度就越大，反之同理。從等高線形狀能看出影響水芫花多糖提取率的各條件交互作用的大小。交互效應(yīng)越顯著的因素間等高線形狀越扁，反之交互效應(yīng)不顯著的因素體現(xiàn)在等高線圖上則為圓形，間接近圓形說(shuō)明交互效應(yīng)不顯著。

如圖5(1)顯示，在料液比為零水平時(shí)，響應(yīng)值都隨著微波功率和提取時(shí)間的變化先增大后減小，曲面的坡度較為明顯，多糖提取率變化明顯，然而呈偏向圓形的等高線圖反映了微波功率與提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)多糖提取率影響不顯著。在圖5(2)中，扁形的等高線圖反映了提取時(shí)間與料液比的交互效應(yīng)對(duì)的提取率呈顯著影響，兩個(gè)因素的影響大小為提取時(shí)間>料液比。圖5(3)表明，提取時(shí)間為零水平時(shí)，微波功率與料液比變化，提取率先升高遲緩降低，在響應(yīng)曲面中心達(dá)最高值，兩者的交互作用顯著。

圖5 兩交互因素對(duì)多提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of two interactive factors on multiple extraction rates

3.5.5 微波提取水芫花多糖的最佳優(yōu)化條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

如表4，經(jīng)Design Expert 軟件分析給出的水芫花多糖提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間=5.84 min，微波功率=300.23 W，料液比=1：35.07 g·mL-1。理論提取率在此情況下為10.074 8%?？紤]到試驗(yàn)的可行性，調(diào)整工藝參數(shù)為：提取時(shí)間=6 min，微波功率=300 W，料液比=1：35 g·mL-1。平行3 次試驗(yàn)得實(shí)際平均提取率為9.963 6%，相對(duì)誤差為1.12%，因此響應(yīng)面模型可用來(lái)指導(dǎo)水芫花多糖提取工藝。

表4 優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值Tab.4 Optimize process experimental value and predicted value

4 討論

天然植物多糖提取的常見(jiàn)方法包括水提沉法，超聲波法以及微波輔助提取法等[9-10]；其中，微波輔助提取法作為一種新興的提取方法，與傳統(tǒng)提取法相比，具有更省時(shí)，耗能更少且純度更高等特點(diǎn)[11-13]；輻射過(guò)程中，高頻的電磁波可以在細(xì)胞內(nèi)部快速產(chǎn)生高溫，裂解細(xì)胞，促使物質(zhì)被萃取[14]。多酚、果膠、皂苷等易分解的物質(zhì)也常選用此方法來(lái)進(jìn)行提取[15-17]。水芫花生長(zhǎng)于熱帶，既具有真紅樹植物的結(jié)構(gòu)特征[18-19]，又兼具半紅樹植物的生長(zhǎng)特性[20-21]，現(xiàn)有研究表明，水芫花提取物具有多種生物學(xué)活性，尤其是水芫花多糖，不但含量豐富，而且具有諸如抗氧化，抗炎，腫瘤抑制等多種效用[22]，應(yīng)用前景不容小覷。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法是一種通過(guò)回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系來(lái)建立模型并分析試驗(yàn)各因素對(duì)結(jié)果影響程度的統(tǒng)計(jì)方法[23-24]，與傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法相比，響應(yīng)面設(shè)計(jì)法具有精度較高，多項(xiàng)式函數(shù)能夠在失效概率上收斂于真實(shí)的隱式極限狀態(tài)函數(shù)的失效概率等特點(diǎn)[25]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于游離氨基酸提取，蔬菜脫水，工程菌提取發(fā)酵以及作物副產(chǎn)品發(fā)酵回收等多種領(lǐng)域的工藝參數(shù)優(yōu)化[26-28]。本研究中，采用響應(yīng)法對(duì)水芫花多糖微波輔助提取的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了芫花多糖提取率與提取時(shí)間、微波功率、料液比的二次回歸模型。由該模型，確立了最優(yōu)參數(shù)為提取時(shí)間6 min，微波功率300 W，料液比1：35 g·mL-1，在最優(yōu)參數(shù)條件下，多糖提取率可以達(dá)9.963 6%，提高顯著。同時(shí)，驗(yàn)證試驗(yàn)的相對(duì)誤差僅為1.12%，說(shuō)明此響應(yīng)面模型準(zhǔn)確、可靠，且具有良好的指導(dǎo)作用。綜上，本試驗(yàn)不但為進(jìn)一步深入研究水芫花多糖提供了參考依據(jù)，還為水芫花資源的開發(fā)及生物學(xué)活性探究提供了理論支持；為水芫花多糖在藥物、食品等領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。