唐明杰 章程 賈亞超 孫玉強 柴益民

帶蒂皮瓣移植技術是臨床常用的修復肢體組織缺損的方法。當皮瓣切取面積超過血管蒂的供血范圍時，常出現(xiàn)因缺血造成的皮瓣部分壞死，影響皮瓣移植效果[1]。因此，增加缺血皮瓣成活面積具有重要的研究意義[2]。小牛血清去蛋白注射液是目前治療缺血性腦血管病的常用藥物，受其可以減輕腦組織缺血再灌注損傷[3-4]和改善供氧、能量供應的啟發(fā)，本研究以大鼠為實驗對象，觀察小牛血清去蛋白注射液對皮瓣缺血壞死及皮瓣成活面積的影響，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 缺血皮瓣模型建立

取雄性清潔級SD大鼠36只，4周齡，體質量300 g，由上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院實驗動物中心提供。經1%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉成功后，在大鼠背部設計遠端蒂隨意皮瓣，長3 cm，寬10 cm，在深筋膜下將皮瓣掀起，徹底止血后使用4-0縫線將皮瓣縫回原處。

1.2 動物分組及處理

將上述大鼠隨機分為3組，分別于術后當天經腹腔注射不同藥物，每天1次，持續(xù)給藥14 d。實驗組給予不同濃度的小牛血清去蛋白注射液(奧德金，錦州奧鴻藥業(yè)有限責任公司)，其中實驗1組給予小牛血清去蛋白注射液30 mg/kg，實驗2組給予小牛血清去蛋白注射液45 mg/kg，而對照組給予生理鹽水。所有大鼠術后單籠飼養(yǎng)，正常進食和活動。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 大體觀察

術后14 d，根據(jù)皮瓣外觀、質地、針刺后出血反應判斷皮瓣成活情況。標記皮瓣壞死-成活界限，拍照后統(tǒng)計皮瓣存活及壞死面積，并計算皮瓣存活率。

1.3.2 組織學檢查

術后14 d，對壞死邊界組織取材并進行HE染色，觀察皮膚組織結構，利用免疫組化染色(CD31、CD34、vWF)檢測血管再生情況。將標本固定于10%福爾馬林液，用石蠟包埋，切成 5 μm 厚的切片。于梯度酒精脫蠟至水，加入枸櫞酸鈉進行抗原修復，用抗CD31、CD34及vWF多克隆抗體進行標記，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。于光學顯微鏡下檢查，并比較各組結果。

1.3.3 凋亡基因及成血管基因檢測

采用逆轉錄聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測凋亡基因BCL-2、BAX及成血管基因eNOS表達。在組織中加入1 mL Trizol試劑研磨徹底后，取上清。根據(jù)說明書指示提取總RNA。然后，取 1 μg RNA 樣本用Amv逆轉錄酶與 oligo dt15 一起逆轉錄成 cDNA。使用 Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑 (Invitrogen, USA)在 7 500 real time PCR 系統(tǒng)(ABI, Invitrogen, USA)完成實時定量 PCR 擴增，檢測BCL-2、BAX、eNOS等相關基因。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大體觀察

所有SD大鼠均成活，無感染或死亡。術后14 d皮瓣壞死界限清晰，實驗1組和2組皮瓣成活率分別為62.2%±6.3%和64.9%±3.5%，均顯著優(yōu)于對照組(47.8%±1.7%)(P<0.01)，其中實驗1組與實驗2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 組織學觀察

HE和免疫組化染色顯示，實驗1組和2組皮膚結構及新生血管數(shù)量均明顯優(yōu)于對照組(圖1)。定量分析顯示，實驗1組和2組新生血管標記物CD31、CD34、vWF密度顯著高于對照組(P<0.01)，實驗1組與實驗2組CD31密度無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，CD34及vWF密度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 HE及免疫組化染色(×200)

圖2 免疫組化定量分析

2.3 相關基因檢測

實驗1組和2組凋亡指標BCL-2及BAX基因表達較對照組顯著下調(P<0.05)，而3組成血管基因eNOS表達無顯著差異(P>0.05) (圖3)，提示小牛血清去蛋白注射液可以下調凋亡基因表達，但對血管指標基因表達無影響。

圖3 BCL-2、BAX及eNOS基因檢測

3 討論

皮瓣移植是修復重建外科治療軟組織缺損的重要方法。盡管皮瓣外科學技術已較成熟，但當皮瓣切取面積過大或修復距離較遠時，仍會出現(xiàn)皮瓣遠端缺血壞死的現(xiàn)象，這也是皮瓣手術最常見的并發(fā)癥。皮瓣移植后，皮瓣血運重建有多種途徑，主要包括蒂部血管供氧、皮瓣內原有血管擴張、皮瓣內新生血管生成及受區(qū)基底和周邊新生血管長入。當?shù)俨垦芄┭蛔銜r，其他途徑便成為皮瓣成活的重要因素。近年來已有多種方法如皮瓣延遲技術、全身或局部藥物、細胞移植、生長因子、基因治療、體外震波治療等用于改善皮瓣手術后血供[5-8]。本研究采用小牛血清去蛋白注射液增加大鼠腹腔缺血皮瓣成活面積，為其臨床應用提供了實驗依據(jù)。

小牛血清去蛋白注射液改善腦及外周神經功能的作用及安全性已得到臨床認可[4]。它是從發(fā)育旺盛的健康小牛血清中提取的一種生物活性物質，包含小分子激活肽、磷酸肌醇寡糖、氨基酸、脂類等。一般認為，前兩者是其主要有效成分。在低氧條件下，細胞內的葡萄糖會發(fā)生無氧糖酵解，產生大量乳酸，乳酸會進一步影響細胞功能，加重細胞損傷。而磷酸肌醇寡糖則可以促進和改善組織細胞對葡萄糖的攝取利用，使葡萄糖利用由無氧酵解向有氧氧化轉化，通過三羧酸循環(huán)和呼吸鏈產生大量能量，既增加了葡萄糖的利用率，又降低了代謝產物對組織的損害，為細胞修復和再生提供了良好條件[3]。李娟等[9]研究小牛血清去蛋白注射液對急性重型顱腦損傷患者腦脊液乳酸濃度的影響，結果顯示治療組乳酸含量從第3天開始出現(xiàn)明顯下降，治療組患者遠期預后也優(yōu)于對照組。

本研究顯示，實驗1組和2組皮瓣平均缺血壞死面積占比較對照組分別減小14.4%和17.1%，成活率較對照組分別提高了30.1%和35.8%；組織學檢測表明，經小牛血清去蛋白注射液治療后缺血皮瓣中有更多的新生血管生成；進一步的基因檢測結果提示，小牛血清去蛋白注射液通過下調調亡基因表達，穩(wěn)定內環(huán)境，而非通過直接上調成血管基因表達來發(fā)揮作用。這表明小牛血清去蛋白注射液在改善缺血皮瓣再生方面起著積極的作用。此結論與文獻報道的小牛血清去蛋白注射液在腦梗塞治療中起作用相輔[10]，即其可有效抑制炎癥因子過度反應，降低機體損傷性反應，但對血管再生基因無明顯調控作用。

綜上所述，小牛血清去蛋白注射液可以通過下調缺血皮瓣凋亡基因表達，改善皮瓣缺血狀態(tài)下細胞能量代謝，從而促進皮瓣新生血管生成，達到增加皮瓣成活面積的治療目的。