梁喜玲
(陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,陜西西安 710048)
膽堿(Choline),又名膽素,是一種含氮的有機堿性化合物,1849 年首次從豬肝中被分離出來,化學(xué)名稱為β - 羥乙基- 三甲胺,分子式為C5H15NO2。在維持正常的人體機能方面膽堿及其衍生物有著極其重要的作用[1]。通常情況下在生物有機體內(nèi)以游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在,一旦缺乏可能會引起干細(xì)胞受損、腎臟損害、記憶力損傷及引起心腦血管等一系列疾病[2-3]。目前,對于人體缺乏膽堿所受影響的相關(guān)研究較多, 雖然人體缺乏膽堿會帶來相關(guān)疾病,但攝入量只需滿足機體需求即可, 無需過量攝入。膽堿及其衍生物是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì),人體在肝臟中可以合成膽堿,但人體自然合成的膽堿不足以滿足人類的正常需要,因此從食物中攝取大部分膽堿是很有必要的[4]。人類必須從飲食中獲得一定量的膽堿,尤其是一些特殊人群,如孕產(chǎn)婦,除正常的飲食攝取外,可適當(dāng)補充一些添加了膽堿的特殊營養(yǎng)物質(zhì)。作為營養(yǎng)強化劑,膽堿的主要化合物來源有氯化膽堿和酒石酸氫膽堿2種形式。
以特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中膽堿的測定為例,對酶比色法和雷氏鹽分光光度法[5]進(jìn)行比較,研究建立快速準(zhǔn)確的膽堿類物質(zhì)檢測方法,對于一些特殊醫(yī)學(xué)用途的配方食品具有重要意義,同時對食品檢測人員更好地開展膽堿檢測工作提供參考。
2 個批次的孕產(chǎn)婦營養(yǎng)配方谷粉,樣本由企業(yè)提供;質(zhì)控樣,中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供。
膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)品;磷脂酶D、膽堿氧化酶和過氧化物酶,美國Sigma 公司提供,酶的保存需要注意其保存條件;酶比色法和雷氏鹽分光光度法中的其他常規(guī)試劑均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。常規(guī)試劑的配制完全依照GB 5413.20—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》中的方法進(jìn)行。
層析柱、250 mL 磨口錐形瓶及回流裝置、電熱恒溫水浴鍋、ATL-224 型電子天平、T9CS 型紫外-可見分光光度計等。
1.3.1 樣本的前處理
2 種測定方法中樣本的前處理過程完全參照國標(biāo)GB 5413.20—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》中的方法進(jìn)行。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
酶比色法中的膽堿氫氧化物標(biāo)準(zhǔn)儲備液(質(zhì)量濃度2.5 mg/mL)、膽堿氫氧化物標(biāo)準(zhǔn)工作液(質(zhì)量濃度250 μg/mL)、雷氏鹽分光廣度法中的膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L) 的配制均參照國標(biāo)方法進(jìn)行。膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液需保存在4±2 ℃冰箱中,且勿超過1 周。
1.3.3 發(fā)色劑配制
取苯酚50 mg、4 - 氨基安替比林15 mg、膽堿氧化酶(100~120 活力單位) 10~15 mg、過氧化物酶(250~280 活力單位) 1.95~2.35 mg 和磷脂酶D(75~100 個活力單位) 1.80~ 2.00 mg 放置于100 mL的容量瓶中,用Tris 緩沖溶液(0.05 mol/L) 稀釋到刻度線,現(xiàn)用現(xiàn)配。
選擇樣本1 孕產(chǎn)婦營養(yǎng)配方谷粉作為精密度測試的研究對象。分別稱取1 號樣本12 份,在相同的試驗條件下,用酶比色法平行測定6 份產(chǎn)品中的膽堿含量,另外6 份用雷氏鹽分光廣度法測其膽堿含量,研究2 種方法的精密度情況。
采用常用軟件Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。
2.1.1 酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)備6 支試管,分別做好標(biāo)記,管A 作為試劑空白管,其余5 支由1~5 編號備用。按照GB 5413.20—2013 中的方法,分別移取一定體積的膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(2,4,6,8 mL) 用蒸餾水定容于10 mL容量瓶。參照表1 中的試劑添加量,加入不同梯度的試劑,然后按照GB 5413.20—2013 中的方法進(jìn)行處理。加入發(fā)色劑后,蓋塞密封、混勻,然后將所有試管放置于37 ℃的恒溫水浴中保溫反應(yīng)15 min。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時的試劑添加量見表1。
表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時的試劑添加量
參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.20—2013 中膽堿的測定方法,將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液用紫外分光光度計進(jìn)行測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL),縱坐標(biāo)為相應(yīng)的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=0.003 0X+0.021 8,R2=0.999 5,線性良好。
酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。
圖1 酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.1.2 雷氏鹽分光光廣度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將層析柱與滴頭用乳膠管連接,層析柱的底部用脫脂棉堵住,添加大約5 cm 高的弗羅里硅土,用甲醇提前浸濕,備用。分別移取一定體積膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL) 于層析柱中,待標(biāo)準(zhǔn)溶液完全進(jìn)入層析柱后,依次用5 mL 和10 mL甲醇,20 mL 乙酸甲酯洗滌,再加入雷納克銨鹽溶液5 mL,過量的雷納克銨鹽用適量的冰乙酸洗滌除去,直至層析柱呈現(xiàn)硅土原有的白色。粉紅色的膽堿雷納克銨鹽用丙酮洗脫,用10 mL 的容量瓶收集并定容,若洗脫液混濁則需用0.45 μm 的濾膜過濾,備用。選定波長526 nm 測定濾液的吸光度,標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為膽堿酒石酸氫鹽含量(mg),縱坐標(biāo)為相應(yīng)吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,所擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=0.038 9X+0.001 1,R2=0.999 2,線性較好。
雷氏鹽分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。
圖2 雷氏鹽分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
樣本的測定中,酶比色法按照表2 所示的試劑添加量進(jìn)行試驗,每個試樣分別準(zhǔn)備(B、C) 2 支試管。在做標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的同時,樣本也參照方法同時進(jìn)行。
樣本測定時的試劑添加量見表2。
表2 樣本測定時的試劑添加量
雷氏鹽分光光度法中移取10 mL 試樣水解液于層析柱中,其余方法均同于2.1.2 中的方法進(jìn)行。
在相同的條件下,將質(zhì)控樣和2 個批次的孕產(chǎn)婦營養(yǎng)配方谷粉總計3 個樣本分別用酶比色法和雷氏鹽分光光度法進(jìn)行測定,2 種方法測定的樣本和質(zhì)控樣的膽堿含量差值均較小。對質(zhì)控樣的膽堿含量測定后,與其理論值117.5 mg/100 g 進(jìn)行比對,對試驗結(jié)果的可靠性進(jìn)行驗證。
2 種方法檢測質(zhì)控樣與2 個樣本的膽堿結(jié)果見表3。
表3 2 種方法檢測質(zhì)控樣與2 個樣本的膽堿結(jié)果
用酶比色法對1 號樣本平行測定6 次,膽堿含量的平均值為156.2 mg/100 g,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.41%;用雷氏鹽分光廣度法測定6 次平行試驗的結(jié)果為154.6 mg/100 g,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.42%,表明2 種膽堿測定方法的精密度較好,且2 種方法測定結(jié)果相差不大,可以滿足檢測要求。
1 號樣本精密度試驗結(jié)果見表4。
表4 1 號樣本精密度試驗結(jié)果
在已探究酶比色法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中膽堿含量方法適用性基礎(chǔ)上,通過對樣本與質(zhì)控樣中膽堿含量的測定發(fā)現(xiàn),酶比色法和雷氏鹽分光光度法的測試結(jié)果較為相近,標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合與精密度試驗均能滿足檢測的要求。酶比色法的專屬性較強且重復(fù)性較好,操作步驟相對簡單容易,但檢出限及酶的價格相對較高,考慮到成本消耗其使用面就受到一定程度的限制;而雷氏鹽分光光度法則需要用到層析柱,前處理較為繁雜且耗時長、樣品易損失,但對設(shè)備要求不高,成本相對低廉,故而在工作中應(yīng)該綜合考慮,結(jié)合實際情況選擇合適的檢測方法。