蒲首丞,胡美娟,陳夢露,鄭 治,尹新忠
(1. 浙江華仕達(dá)茶業(yè)股份有限公司,浙江 武義 321200;2. 浙江華茗園茶業(yè)有限公司,浙江 永康 321300;3. 浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321000;4. 浙江省永康市食品與藥品檢測中心,浙江永康 321300)
近年來,抹茶作為一種健康天然飲品,受到人們的歡迎,由于覆蓋栽培及特殊加工方法,抹茶極大地保持了綠茶鮮葉原有的天然色澤及營養(yǎng)保健功效成分。抹茶保留了茶葉中的100 多種成分,主要為茶多糖、茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸、葉綠素、蛋白質(zhì)、芳香物質(zhì)、纖維素,還有大量的維生素和礦物質(zhì),其中茶氨酸和葉綠素含量都比較高,這些生物活性成分使得抹茶具有改善血液流動、改善心血管疾病、緩解壓力、安眠功效、降血脂、降血糖等作用[1-2]。茶氨酸和茶多酚是抹茶主要成分,茶氨酸(N - 乙基γ - 谷氨酰胺) 是一種酰胺類化合物,天然存在的茶氨酸均為L 型,是茶葉中特有非蛋白類氨基酸,具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)及非常高水溶性,占茶葉中游離茶氨酸的一半作用,可以減弱茶的苦澀味,增加茶鮮美的味道,可作為一種食品添加劑使用[2-4]。許多科學(xué)研究表明,茶氨酸具有增強(qiáng)人體免疫力、降低血壓、抑制癌細(xì)胞生長、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制神經(jīng)元的凋亡、松弛神經(jīng)緊張、安神作用等作用[4-7]。目前,關(guān)于茶多酚研究比較多,特別是兒茶素類活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗高血壓等作用[8]。
基于UPLC-MS 測定抹茶中主要6 種特征性成分,主要包括茶氨酸和兒茶素類成分,分析2020 年春茶同一茶園不同時間段抹茶主要成分變化,通過聚類分析不同時間段的樣品,以期為抹茶質(zhì)量控制提供參考。
1.1.1 原料
抹茶,2020 年春茶(鳩坑)。
1.1.2 試劑
乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純;水;標(biāo)準(zhǔn)品:茶氨酸(L-The)、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG),上海安譜試驗科技股份有限公司提供;咖啡堿(CAF),中國計量科學(xué)研究院提供。
1.1.3 儀器設(shè)備
JYL-C020E 型多功能料理機(jī),九陽股份有限公司產(chǎn)品;FA2004 型電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;TG16-WS 型臺式高速離心機(jī),湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品;HH-600 型數(shù)顯恒溫循環(huán)水箱,常州智博瑞儀器制造有限公司產(chǎn)品;1290 Infinity 型超高效液相色譜儀、色譜柱(ZORBAX Eclipse Plus C18型,2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、保護(hù)柱(ZORBAX Eclipse Plus C18型,2.1mm×50 mm,1.8μm),安捷倫公司產(chǎn)品;4500 型三重四極桿質(zhì)譜TRIPLE QUAD 4500,AB Sciex 公司產(chǎn)品。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備
標(biāo)液:精確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg,分別用70%甲醇水溶解后定容至10 mL 棕色容量瓶中,得質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL 儲備母液,不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用儲備母液稀釋配制。
混和標(biāo)準(zhǔn)品溶液見表1。
表1 混和標(biāo)準(zhǔn)品溶液
1.2.2 供試品制備
供試液:稱取0.2 g 樣品,加入在70 ℃預(yù)熱過的70%甲醇溶液50 mL,混于100 mL 錐形瓶中,于70 ℃水浴中浸提20 min(5 min 攪拌1 次),冷卻后轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,搖勻。移液管移取1 mL 上清液于100 mL 容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,搖勻,過0.22 μm濾膜,待測。
1.2.3 UPLC- MS 分析條件
(1) 色譜條件。流動相:乙腈(流動相A)、0.1%甲酸水溶液(流動相B),流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,柱溫40 ℃,運行時間15 min。
流動相梯度見表2。
表2 流動相梯度
(2) 質(zhì)譜條件。離子源:電噴霧離子源(ESI),掃描模式:正離子模式,掃描方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM),離子化電壓5 500 V,加熱溫度450 ℃,噴霧氣GS1 50 psi,輔助加熱氣GS2 50 psi,碰撞氣CAD 8,氣簾氣CUR35 psi,MRM離子對信息。
MRM離子對信息見表3。
表3 MRM 離子對信息
1.2.4 方法學(xué)考查
(1) 線性關(guān)系考查。精密吸取不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)照品溶液分析,1 μL 進(jìn)樣,測其峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣含量為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)作圖,得到線性回歸方程,求相關(guān)系數(shù)R。
(2) 精密度試驗。精密吸取配制的對照品溶液1 μL 進(jìn)樣,依上述色譜條件測定,重復(fù)進(jìn)樣6 次,測定計算目標(biāo)峰面積,計算RSD 值。
(3) 穩(wěn)定性試驗。取制備的供試樣品溶液,于0,2,4,6,8,10 h 進(jìn)樣測定,按1.2.3 色譜分析條件,進(jìn)樣量為1 μL,測定目標(biāo)峰面積,計算RSD 值。
(4) 重復(fù)性試驗。取樣品按1.2.2 方法制備供試品溶液6 份,按1.2.3 色譜分析條件,進(jìn)樣量為1 μL,測定峰面積,計算RSD 值。
(5) 加樣回收試驗。精密稱取已知含量的茶樣品3 份,分別精密加入一定量高中低對照品,按
1.2.2 供試品溶液制備方法制備樣品溶液,依上述色譜條件測定含量。
1.2.5 樣品含量測定
取不同時間段采集生產(chǎn)加工抹茶,以1.2.2 進(jìn)行前處理,在按1.2.3 色譜分析條件進(jìn)行測定,檢測不同抹茶樣品中的茶氨酸、兒茶素類和咖啡因含量。
1.2.6 聚類分析
以6 批樣品的7 個主要特征成分含量為指標(biāo),運用SPSS19 統(tǒng)計分析軟件,進(jìn)行聚類分析。
2.1.1 線性關(guān)系考查
混合標(biāo)準(zhǔn)品UPLC-MS 色譜圖見圖1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。
圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品UPLC-MS 色譜圖
表4 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)
圖1 為混合標(biāo)準(zhǔn)品UPLC-MS 色譜圖,表4 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG 和ECG 的色譜保留時間標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果表明,抹茶中7 種化合物靈敏度較高,在給定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.1.2 精密度試驗
精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值見表5。
表5 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值/%
表5 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG和ECG 的精密度試驗RSD 值,分別為2.83%,4.42%,1.67%,2.03%,0.92%,3.66%和1.96%,結(jié)果表明試驗儀器要具有較好的精密度。
2.1.3 穩(wěn)定性試驗
取制備的供試樣品溶液于0,2,4,6,8,10 h進(jìn)樣測定,表5 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG 和ECG 的穩(wěn)定性試驗RSD 值,分別為5.74%,3.75%,4.36%,3.09%,2.58%,7.44%和3.39%,供試品溶液中EGCG 的穩(wěn)定性沒有其他成分高。
2.1.4 重復(fù)性試驗
表5 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG和ECG 的供試品重復(fù)性試驗RSD 值,分別為1.91%,2.24%,4.16%,6.55%,1.51%,1.98%和1.34%,表明茶樣具有較好重復(fù)性。
2.1.5 加標(biāo)樣回收試驗
添加1 mL 選擇已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品作為本底樣品,在本底樣品中準(zhǔn)確加入低、中、高3 個質(zhì)量濃度的混標(biāo),然后進(jìn)行分析。
7 種多酚物質(zhì)的加標(biāo)樣回收率分析見表6。
表6 7 種多酚物質(zhì)的加標(biāo)樣回收率分析
樣品含量分析見表7。
表7 樣品含量分析/ mg·g-1
采用該方法測定的浙江武義同一個茶園不同時期生產(chǎn)抹茶樣品7 種特征化合物,其中茶氨酸變化最明顯,下降最多,兒茶素類呈現(xiàn)緩慢降低,具體結(jié)果見表7。前3 d,茶葉中茶氨酸的含量較高為24 mg/g,在5 d 后茶氨酸含量降低50%左右,為13 mg/g,與感官審評結(jié)果相符合,前3 d 抹茶滋味清鮮、略帶海苔味,后幾天茶樣微澀,也與其他科研人員關(guān)于茶氨酸對抹茶品質(zhì)呈正相關(guān)的研究一致[9]。
以抹茶主要特征成分L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG 和ECG 為指標(biāo),采用組間聯(lián)接法、平方Euclidean 距離度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。
聚類分析見圖2。
圖2 聚類分析
當(dāng)距離大于15 時,樣品可分為2 類,其中day1和day3 抹茶為一類,day5,day7,day9 和day11 聚為一類;當(dāng)距離在10 左右時,可將6 個時間短樣本很好的分為3 類,其中day1 和day3 抹茶仍為一類,day5,day7,day9 聚為一類;day11 單獨聚為一類。由此可見,不同生長時間段抹茶的主要特征生化成分隨時間在不停變化,其中茶氨酸變化最大,通過統(tǒng)計聚類分析可以很好地區(qū)分不同時間段抹茶,對抹茶等級劃分具有較好指導(dǎo)意義。
建立了UPLC-MS 同時測定抹茶中7 特征性化合物的分析方法,具有靈敏度高、準(zhǔn)確穩(wěn)定、方便快捷等特點,適合于茶葉中茶氨酸兒茶素和咖啡堿類化合物的快速測定。