余 艷,牛 敏,杜 艷,任玉吉,代鵬飛,何秋月,劉淑敏

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗診斷省創(chuàng)新團隊，云南 昆明 650032)

新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)可水解幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，產(chǎn)NDM-1的細菌引起的感染臨床致死率較高[1]。陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae，ECL)是一種重要的條件致病菌，可以產(chǎn)生多種抗生素水解酶，目前研究[1-2]顯示產(chǎn)碳青霉烯酶尤其是NDM-1是耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobactercloacae, CRECL)的主要耐藥機制。

除了產(chǎn)生各種抗生素水解酶以外，ECL也能表達多種毒力因子，包括菌毛、蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)、毒力島、脂多糖、鐵載體、毒素、外排泵等，這些毒力因子在細菌黏附、入侵宿主、免疫防御、引起宿主損傷的過程中發(fā)揮重要作用[3-7]。ECL含有豐富的質(zhì)粒和染色體基因組，易于獲得包含耐藥基因和毒力基因的多種可移動遺傳元件，二者的遺傳機制主要通過基因水平轉(zhuǎn)移而實現(xiàn)[5]，并且相互關(guān)聯(lián)，在細菌的進化過程中發(fā)揮重要作用[8]。通常情況下，細菌在獲得耐藥性后，由于適應(yīng)性代價的原因，會導(dǎo)致毒力下降[9]。然而，隨著菌株突變，耐藥菌可通過補償性進化機制使其毒力和生存能力增強[10]，使得臨床感染治療更加困難。國內(nèi)外研究[4, 11]表明，攜帶NDM-1基因會對ECL的致病性產(chǎn)生一定影響，但目前相關(guān)研究較少。因此，本研究擬分析攜帶NDM-1基因ECL的耐藥特點、毒力基因攜帶情況，為進一步研究NDM-1基因?qū)CL毒力、致病性的影響提供幫助，甚至為研究新穎有效的抗感染療法、緩解致病菌感染及耐藥現(xiàn)狀提供新視角。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2017年1月—2020年11月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離鑒定的ECL，試驗組為29株產(chǎn)NDM-1的CRECL，對照組為32株不產(chǎn)NDM-1的CRECL及同期分離的35株碳青霉烯類敏感ECL(CSECL)，剔除同一患者不同部位分離的重復(fù)菌株。根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南，CRECL的判讀標(biāo)準為：亞胺培南或美羅培南 MIC ≥ 4 μg/mL或厄他培南 MIC ≥ 2 μg/mL，根據(jù)NDM-1基因檢測結(jié)果進一步將CRECL分為產(chǎn)NDM-1和不產(chǎn)NDM-1菌株，CSECL菌株對碳青霉烯類藥物均表現(xiàn)為敏感。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和ECL ATCC 700323 均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 VITEK 2全自動微生物鑒定及藥敏分析儀(法國梅里埃公司)、基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜儀MALDI-TOF MS(布魯克科技有限公司)、藥敏紙片(英國Oxoid公司)、DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、DNA Marker(大連寶生物公司)、2×Taq PCR Master Mix、Golden View 核酸染料、50 ×TAE Buffer(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)、瓊脂糖(西班牙Biowest 公司)、引物合成及 DNA 測序(北京擎科生物科技有限公司昆明分公司)、PCR擴增儀(西安天隆科技有限公司)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、凝膠成像儀(美國GE Healthcare公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與藥敏試驗 采用VITEK 2 Compact進行菌種鑒定，MALDI-TOF MS復(fù)核菌種鑒定結(jié)果，全自動藥敏系統(tǒng)聯(lián)合K-B紙片法進行藥敏試驗，替加環(huán)素和多粘菌素的藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法。試驗操作及結(jié)果判識參照CLSI M100(第28版)標(biāo)準[12]。

1.2.2 NDM-1耐藥基因與毒力基因檢測 提取分離菌株DNA作為PCR擴增模板。采用PCR方法對61株CRECL進行NDM-1耐藥基因擴增，引物序列及反應(yīng)條件參照文獻[13]進行。對所有96株ECL菌株進行24種毒力基因包括耶爾森毒力島基因(irp-2、fyuA)、鐵載體基因(fhuA、sodB、sltA)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)編碼基因(escV、nleB)、Ⅴ型分泌系統(tǒng)(T5SS)編碼基因(pic、pet)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)編碼基因(clpB、icmf、VasD/Lip)、脂多糖基因(WaaL、WaaG)、Ⅰ型菌毛基因(fimH)、Ⅲ型菌毛基因(mrkD)、生物膜胞外多糖基因(wcaA、wcaM、wza)、外排泵基因(acrA、tolC)、志賀腸毒素基因(shET1)、細胞毒性壞死因子基因(cnf1)、溶血素基因(hlyA)，引物序列、反應(yīng)條件、產(chǎn)物大小參照相關(guān)文獻[3-7, 14]。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳(120 V×30 min)后，在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察。擴增陽性產(chǎn)物送測序并將測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列比對驗證。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用卡方檢驗(Chi-square test)比較組間分布差異，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDM-1耐藥基因檢出率 2017年1月—2020年11月共收集61株CRECL，經(jīng)PCR擴增測序比對，有29株檢出NDM-1基因，檢出率為47.5%。圖1為部分菌株NDM-1基因電泳圖。

M：DNA Marker(DL 2000)；1～8：NDM-1基因陽性菌株；9：陽性對照；10：陰性對照。

圖2 29株產(chǎn)NDM-1的CRECL對常用抗菌藥物耐藥率

2.3 毒力基因 96株ECL菌株中，外排泵和生物膜胞外多糖編碼基因acrA、tolC、wcaA、wcaM、wza的檢出率較高，分別為80.2%、90.6%、87.5%、75.0%、92.7%, T6SS編碼基因clpB、icmf、VasD/Lip的檢出率也均在60%以上，未檢出escV、nleB、pet、hlyA等毒力基因。

2.3.1 產(chǎn)NDM-1的CRECL和不產(chǎn)NDM-1的CRECL毒力基因分布差異 產(chǎn)NDM-1酶 CRECL組檢出率最高的是acrA基因(96.6%)，不產(chǎn)NDM-1酶CRECL菌株檢出率最高的是wza基因(90.6%)，產(chǎn)NDM-1的CRECL菌株clpB、icmf、VasD/Lip、acrA檢出率高于不產(chǎn)NDM-1的CRECL，而不產(chǎn)NDM-1的CRECL組wcaM基因檢出率高于產(chǎn)NDM-1的CRECL組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 產(chǎn)NDM-1和不產(chǎn)NDM-1的CRECL毒力基因檢出情況[株(%)]

2.3.2 CRECL和CSECL毒力基因分布差異 CRECL和CSECL菌株中檢出率最高的都是wza基因，分別為91.8%和94.3%。CRECL組clpB、icmf、VasD/Lip基因檢出率高于CSECL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其余毒力基因的檢出率不具有統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。見表2。

表2 CRECL和CSECL兩組菌株的毒力基因檢出情況[株(%)]

3 討論

ECL是一種重要的革蘭陰性桿菌，可引起多種感染。據(jù)報道[15]，由其引起的醫(yī)療保健相關(guān)感染在所有腸桿菌目細菌中排名第三。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛應(yīng)用，全球各地相繼出現(xiàn)CRECL播散流行，全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)結(jié)果顯示，2015—2019年ECL對碳青霉烯類抗生素的耐藥率為3.4%～7.0%[16]，多項研究顯示NDM-1酶是CRECL中最常見的碳青霉烯酶，檢出率為53%～72%，并且多地都出現(xiàn)過產(chǎn)NDM-1的ECL暴發(fā)流行[1-2，15，17]。本研究收集了61株CRECL，NDM-1基因檢出率為47.5%(29/61)，比同類報道的檢出率稍低,說明NDM-1基因檢出率存在地區(qū)差異，也比前期課題組的檢出率(80%)低[13]，提示本地區(qū)產(chǎn)NDM-1的ECL流行病學(xué)特征可能發(fā)生了重要變遷，為臨床防控提供了重要的流行病學(xué)依據(jù)。藥敏結(jié)果顯示29株產(chǎn)NDM-1的CRECL均為多重耐藥，與類似報道一致[18]。阿米卡星是氨基糖苷類抗生素，其耐藥率較低，主要是由于腎毒性、耳毒性等副作用，使用一直受到限制。大部分菌株對氨基糖苷類、喹諾酮類抗生素表現(xiàn)出較高的敏感性，因此可根據(jù)藥敏結(jié)果選擇性使用一種或兩種藥物進行抗感染治療。理論上NDM-1不能水解氨曲南，但本研究中氨曲南的耐藥率達44.8%，主要是因為攜帶NDM-1基因的質(zhì)粒常同時攜帶多種耐藥基因編碼多種抗生素水解酶，也包括能水解氨曲南的ESBLs和/或 AmpC 酶，從而導(dǎo)致氨曲南耐藥甚至泛耐藥。多粘菌素和替加環(huán)素是目前治療此類細菌感染的主流選擇，大部分菌株對其敏感率較高，研究顯示使用替加環(huán)素、多粘菌素聯(lián)合其他藥物可顯著提高患者的臨床治療效果[19]，但由于多粘菌素副作用大、替加環(huán)素價格昂貴等多種原因限制了這兩種藥物的應(yīng)用和普及，隨著對這兩種藥物耐藥菌株的出現(xiàn)，進一步加劇了臨床抗感染治療的難度,甚至可能出現(xiàn)無藥可用的境地。再加上目前尚缺乏針對NDM-1的常規(guī)標(biāo)準化表型檢測方法以及能有效治療多重耐藥產(chǎn)NDM-1酶細菌的抗生素[20]，且多數(shù)攜帶NDM-1基因的菌株可通過質(zhì)粒進行廣泛克隆播散[21]，如果攜帶大量毒力基因的移動遺傳元件轉(zhuǎn)移到耐藥質(zhì)粒中，就會產(chǎn)生高耐藥合并高毒力菌株，給臨床感染控制和公共健康帶來極大威脅。

毒力是細菌的重要致病因素，在感染中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外研究顯示NDM-1基因不僅賦予腸桿菌目細菌高度耐藥性，而且還能使肺炎克雷伯菌毒力增強[22]、ECL的繁殖能力與致病性增強[12]，課題組前期研究顯示攜帶NDM-1基因會使ECL體外生長能力增強[23]。目前有研究[24]表明攜帶NDM-1基因的大腸埃希菌毒力基因攜帶率較低，但攜帶NDM-1基因與ECL毒力基因檢出率的相關(guān)性未見報道，因此本研究分析了產(chǎn)NDM-1和不產(chǎn)NDM-1的CRECL之間以及CRECL和CSECL之間毒力基因的分布差異。

結(jié)果顯示產(chǎn)NDM-1的CRECL菌株clpB、icmf、VasD/Lip、acrA檢出率顯著高于不產(chǎn)NDM-1的CRECL(P<0.05)。clpB、icmf、VasD/Lip是T6SS編碼基因，與細菌的毒力密切相關(guān)。敲除T6SS相關(guān)編碼基因的鮑曼不動桿菌，其生長速度減慢,對細胞黏附能力降低，對小鼠的致死能力降低[25]。本研究中T6SS在ECL中普遍存在，與Mustafa等[3]報道一致，并且在產(chǎn)NDM-1 ECL中的攜帶率更高。acrA基因是AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的編碼基因，可以增加細菌的適應(yīng)性和毒力[6]，產(chǎn)NDM-1的CRECL菌株中的攜帶率更高。因此，產(chǎn)NDM-1的ECL不僅耐藥性強，而且某些毒力基因的攜帶率更高，可能會導(dǎo)致其毒力增強，但毒力基因的攜帶率與其在體內(nèi)致病性強弱的關(guān)系需要進一步試驗驗證。另外，Guérin等[26]研究表明ECL復(fù)合體中AcrAB-TolC 外排泵缺失會導(dǎo)致菌株毒力減弱，而生物被膜的產(chǎn)量卻增加。生物膜的結(jié)構(gòu)組成、功能行使均與胞外多糖密切相關(guān)[27]，wcaM基因是ECL生物膜胞外多糖合成基因。本次試驗結(jié)果表明產(chǎn)NDM-1的CRECL組acrA基因檢出率顯著增高而wcaM基因檢出率則顯著降低，但對于產(chǎn)NDM-1的CRECL菌株外排泵與生物膜的關(guān)系還需要更多試驗驗證。

目前對耐碳青霉烯類腸桿菌的毒力研究主要集中在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，大量研究報道耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌株給臨床治療帶來了極大困擾，其重要分子特征是同時攜帶碳青霉烯耐藥質(zhì)粒及毒力質(zhì)粒[28]，也有研究顯示耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的毒力顯著增強[29]，Gomez-Simmonds等[30]研究表明CRECL增強了耐藥基因的傳播能力，但并沒有提高毒力。本研究結(jié)果顯示T6SS編碼基因clpB、icmf、VasD/Lip在CRECL中的檢出率顯著高于CSECL菌株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，表明T6SS作為毒力因子，在ECL中普遍存在并且與耐藥性存在一定關(guān)聯(lián)，CRECL往往合并T6SS的高檢出率。

綜上所述，攜帶NDM-1基因ECL伴隨clpB、icmf、VasD/Lip、acrA毒力基因的高檢出率，從而可能導(dǎo)致其毒力發(fā)生改變，但本研究收集的菌株樣本量有限，僅從基因水平進行分析，若要探討NDM-1基因?qū)CL毒力的影響，除了擴大樣本量以外，可能還需要結(jié)合臨床感染特征，進行細胞、動物試驗進一步論證。由于耐藥菌的不斷突變及全球傳播，側(cè)重于對抗病原菌毒力因子的抗毒力治療已經(jīng)成為一種新的治療策略[31],本文也可為研究新穎抗感染療法提供一些新視角。總之，為防止高耐藥合并高毒力菌株的出現(xiàn)，除了積極開發(fā)抗菌藥物以外，醫(yī)療機構(gòu)還要對產(chǎn)NDM-1的ECL進行流行病學(xué)監(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)多重耐藥高危菌株，及時采取感染控制措施，防止其暴發(fā)流行。