方奇挺 金 晶 朱雨夢 葉儉慧 董俊杰 梁月榮

（1.浙江大學茶葉研究所，浙江 杭州 310058；2.浙江省農(nóng)業(yè)技術推廣中心，浙江 杭州 310000；3.浙江駱駝九宇有機食品有限公司，浙江 杭州 310000）

蒸青綠茶是采用“高溫、短時”的蒸汽殺青工藝制成的綠茶，具有干茶色澤深綠、茶湯淺綠和茶底青綠的“三綠”品質(zhì)特征［1－2］。玉露是日本的高級綠茶，品質(zhì)優(yōu)良，在采摘前經(jīng)過二十天左右的遮蔭處理，再經(jīng)蒸汽殺青等加工工藝制作而成，具有滋味甘甜、苦澀味少，干茶色澤深綠，呈針狀，具有獨特的嫩香和收斂風味［3］。由于綠茶具有抗衰老、防輻射、提神醒腦、降血糖等健康功效［4］，綠茶的市場需求量一直較高。蒸青綠茶因具有優(yōu)良的品質(zhì)產(chǎn)銷量增長迅速，已成為我國綠茶產(chǎn)品的重要品類［5］，同時蒸青綠茶亦是茶飲料的重要原料。

覆蓋遮蔭是生產(chǎn)玉露茶必要的茶園栽培管理措施，能明顯改善茶葉的滋味和湯色［6］。一般采用棚架覆蓋或直接覆蓋進行茶園遮蔭，而覆蓋材料、遮光度、覆蓋時間以及生產(chǎn)季節(jié)均會影響遮蔭的效果和蒸青綠茶的品質(zhì)［7］。研究表明覆蓋遮蔭能夠通過提高茶葉葉綠素含量而明顯改善茶葉色澤，使其更綠［8］。此外，覆蓋遮蔭還能降低茶多酚含量［9］，改變兒茶素類化合物組成［10］，提高茶樹葉片中游離氨基酸的含量［11］。但，只有適度的遮光能促進茶樹中氨基酸的積累，但遮光過度不利于氨基酸的積累［12］。一般認為，咖啡堿與氨基酸同屬氮代謝，在遮蔭過程中的變化趨勢與氨基酸變化趨勢較為一致。遮蔭后茶葉揮發(fā)性物質(zhì)含量和香氣種類均明顯增加，香氣組分得以優(yōu)化［13］。由于覆蓋遮蔭對茶葉品質(zhì)的明顯提升作用，可用于夏秋茶品質(zhì)的改良，從而進一步提高夏秋茶資源的綜合利用度。而目前，關于不同生產(chǎn)季節(jié)或不同生產(chǎn)月份所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶品質(zhì)成分的差異尚不明確。

本研究通過測定同一時期遮蔭與未遮蔭兩種栽培措施所制蒸青玉露茶生化成分，以及同一茶樹品種在不同生產(chǎn)月份所制蒸青綠茶的生化成分，探討栽培措施和生產(chǎn)季節(jié)對蒸青綠茶主要滋味成分和揮發(fā)性物質(zhì)含量的影響，為蒸青綠茶生產(chǎn)的品質(zhì)控制提供基礎數(shù)據(jù)，同時為開發(fā)夏秋茶資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

供試玉露茶（蒸青綠茶）原料采自徑山九宇有機茶園。根據(jù)同一采摘標準（一芽二葉）和相同覆蓋時間（20天），采摘4月覆蓋遮蔭、5月覆蓋遮蔭、6月覆蓋遮蔭、8月覆蓋遮蔭以及4月未遮蔭（對照）的同一茶樹品種（鳩坑群體種）鮮葉，經(jīng)蒸青綠茶生產(chǎn)線制成。甲酸（色譜純）、沒食子酸（GA，≥98%）、沒食子兒茶素（GC，≥98%）、表沒食子兒茶素（EGC，≥98%）、兒茶素（C，≥98%）、表兒茶素（EC，≥98%）、表沒食子兒茶素酸酯（EGCG，≥98%）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG，≥98%）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG，≥98%）、兒茶素沒食子酸酯（CG，≥98%）和咖啡堿（caffeine，≥98%）購自阿拉丁試劑公司（上海，中國）。乙腈（色譜純）購自Merck公司（達姆施塔特，德國），乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、水合茚三酮、氯化亞錫、碳酸鈉、谷氨酸、氯化鈉均為分析純，采購于國藥試劑集團化學試劑有限公司（上海，中國）。茶氨酸標準品（Thea，≥99%）購自Sigma公司（圣路易斯，美國）。愈創(chuàng)木酚（guaiacol，≥99%）購自阿拉丁公司（上海，中國）。

1.2 設備

紫外可見分光光度計UV-2800S型（上海尤尼柯儀器有限公司）、LC-20 AD高效液相色譜儀（日本島津公司）、QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶湯提取方法 將茶樣研磨成粉末并過0.45 mm篩，稱取150 mg干茶，用25 mL的50%乙醇溶液于70℃浸提20 min。經(jīng)4500 rpm和4℃離心10 min后，取上清液用于化學成分檢測。

1.3.2 茶多酚含量檢測 參照GB／T 8313－2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》。

1.3.3 游離氨基酸總含量測定 參照GB／T 8314－2013《茶 游離氨基酸總量測定》。

1.3.4 HPLC法檢測兒茶素類化合物和咖啡堿濃度 待測樣品在12000 rpm、4℃條件下離心10 min，取上清液用于HPLC檢測，具體方法參照已發(fā)表文獻［14］。HPLC檢測條件：安捷倫TC 4.6 mm×250 mm C18色譜柱，柱溫33℃，A流動相：乙腈／乙酸／水＝3／0.5／96.5，B流動相：乙腈／乙酸／水＝30／0.5／69.5，洗脫梯度：前35 min內(nèi)流動相B由20%線性增加至65%，并保持65%B相5 min，40 min后20%B相平衡5 min，進樣量10μL，流速1 mL／min，紫外檢測波長280 nm。采用外標法進行定量分析。

1.3.5 茶氨酸檢測方法 參照GB／T 23193－2017《茶葉中茶氨酸的測定 高效液相色譜法》。

1.3.6 水浸出物檢測方法 參照GB／T 8305－2013《茶 水浸出物測定》。

1.3.7 揮發(fā)性物質(zhì)含量檢測方法 采用QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對揮發(fā)性化合物進行分析，具體方法參照已發(fā)表文獻［15］。茶樣研磨后過0.6 mm篩。取1.00 g茶粉樣品加入50 mL的去離子水置于70℃提取10 min。冷卻至室溫后在25℃和8000 rpm條件下離心10 min后取上清液。取10 mL上清液于20 mL頂空瓶中，加入20μL內(nèi)標愈創(chuàng)木酚（100μg／mL）和2 g烘干后的NaCl，然后立即密封頂空瓶；插入50／30μm固相微萃取吸附纖維頭（DVB／CAR／PDMS，思必可有限公司，美國），在40℃下吸附1 h。而后，將固相微萃取吸附頭插入250℃的GC-MS進樣口中解吸附3.5 min，并按以下條件進行GC-MS分析：色譜柱HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25μm，安捷倫公司，美國），載氣（氦氣，99.999%），流速1.0 mL／min，進樣口溫度250℃，離子源溫度200℃，不分流進樣；離子化方式EI，電子能量為70 eV，MS掃描范圍35－400 m／z；柱溫箱程序為前10 min保持50℃→3℃／min的速度增加到150℃→在150℃維持1 min→以15℃／min的速度增加到230℃→230℃維持3 min。

將化合物的質(zhì)譜圖與NIST質(zhì)譜庫提供的標準質(zhì)譜圖進行比對，參考文獻中的相關化合物的保留指數(shù)，對揮發(fā)性物質(zhì)進行定性分析。采用內(nèi)標法（愈創(chuàng)木酚），根據(jù)以下公式對各揮發(fā)性物質(zhì)進行相對定量。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSSStatistic軟件（IBM公司，美國）進行顯著性分析。采用Minitab 19軟件（上海泰珂瑪信息技術有限公司，中國）進行主成分分析（PCA分析）。圖3采用Tbtools［16］軟件（華南農(nóng)業(yè)大學，中國）Normalized選項以Scale method進行均一化處理制作熱圖，其中圖A采用列均一化、行聚類分析；圖B采用行均一化、列聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 覆蓋遮蔭對蒸青綠茶主要品質(zhì)成分的影響

表1為覆蓋遮蔭對蒸青綠茶品質(zhì)相關指標的影響。4月份，覆蓋遮蔭和未遮蔭（對照）茶樣的茶多酚含量分別為151.3 mg GA／g干茶和144.9 mg GA／g干茶，無顯著差異。覆蓋遮蔭茶樣的游離氨基酸總含量為64.1 mgThea／g干茶，是對照的2.54倍?？梢姡采w遮蔭可以顯著提高蒸青綠茶游離氨基酸總含量，但在4月份覆蓋遮蔭對蒸青綠茶的茶多酚含量影響不顯著。該結(jié)果與之前報道的覆蓋遮蔭顯著減少春茶茶多酚含量，增加氨基酸含量的結(jié)果有所不同［10］，這可能與所采用的茶樹品種及制樣方法的不同有關。酚氨比值是茶多酚總量與氨基酸總量之比，是反映茶湯滋味的重要指標。酚氨比值較高，茶湯苦澀味較明顯。因此，一般認為酚氨比值較低的原料比較適合制作綠茶［17］。如表1所示，4月未遮蔭樣品的酚氨比值為5.75，而覆蓋遮蔭蒸青綠茶的酚氨比值為2.36，這主要是由于遮蔭樣品氨基酸總量的增加，說明覆蓋遮蔭有助于增強蒸青綠茶的鮮爽度進而提高其品質(zhì)。特別是，覆蓋遮蔭蒸青綠茶的茶氨酸含量顯著提高，是對照茶樣的6.97倍。遮蔭樣品和對照的水浸出物含量無顯著差異，但咖啡堿含量存在顯著差異。遮蔭樣品的咖啡堿含量為19.63 mg／g，顯著高于對照的10.93 mg／g。該結(jié)果與陸安霞等的研究結(jié)果一致［18］，說明適度遮蔭能促進茶樹葉片生物堿的合成。

表1 覆蓋遮蔭對蒸青綠茶主要品質(zhì)相關指標的影響

兒茶素類化合物是茶葉中最重要的多酚組分。表2為覆蓋遮蔭對蒸青綠茶兒茶素類化合物含量的影響。覆蓋遮蔭蒸青綠茶的總兒茶素類含量為86.12 mg／g，顯著低于對照的95.55 mg／g?？梢?，遮蔭能降低蒸青綠茶總兒茶素類的含量，這主要由于非酯型兒茶素EGC、GC和EC含量的下降。孫京京等發(fā)現(xiàn)遮蔭處理能夠明顯降低春季綠茶EGC、EC的含量，而EGCG含量略有上升［10］。

表2 覆蓋遮蔭對蒸青綠茶兒茶素類化合物含量的影響（mg／g）

2.2 不同生產(chǎn)時間對覆蓋遮蔭蒸青綠茶主要呈味物質(zhì)的影響

不同生產(chǎn)時間覆蓋遮蔭蒸青綠茶的茶多酚含量和游離氨基酸總含量變化如圖1（A）所示。其中，8月所制蒸青綠茶的茶多酚含量最高，為166.9 mg沒食子酸（GA）／g，顯著高于4月、5月和6月所制樣品；而4月、5月和6月所制蒸青綠茶樣品的茶多酚含量沒有顯著差異，約為160 mg GA／g干茶。從4月至8月，所制茶樣的游離氨基酸總含量從4月份的64.1mg Thea／g干茶下降到8月份的27.0 mg Thea／g干茶，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢?？梢?，雖然覆蓋遮蔭對蒸青綠茶的氨基酸總含量有明顯提升作用，但來自生產(chǎn)季節(jié)的影響仍非常顯著，夏秋季所生產(chǎn)的蒸青綠茶游離氨基酸總含量明顯低于春季蒸青綠茶。圖1（B）為不同時間所制蒸青綠茶的酚氨比值。從4月至8月，蒸青綠茶的酚氨比值從2.36逐漸上升至6.17，這主要是由于游離氨基酸總含量的顯著下降。從滋味品質(zhì)成分的角度來看，夏秋季節(jié)生產(chǎn)的覆蓋遮蔭蒸青綠茶滋味品質(zhì)不如春季所制茶樣。

圖1 不同月份所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶的茶多酚、游離氨基酸含量（A）和酚氨比值（B）

表3為不同月份所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶的兒茶素類化合物含量?？梢姡?月所制蒸青綠茶總兒茶素類含量為86.12mg／g，顯著低于5月、6月、8月所制茶樣（102.56～113.15 mg／g），且8月份所制茶樣的總兒茶素類含量最高。這說明夏秋季節(jié)覆蓋遮蔭蒸青綠茶的總兒茶素類含量較春季樣品高，這與茶多酚含量變化趨勢整體一致。從4月到8月，所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶樣品中表型兒茶素類總含量呈現(xiàn)整體上升趨勢；而非表型兒茶素類總含量變化不大。不同月份所制蒸青綠茶的沒食子酸兒茶素類含量介于64.65～89.18 mg／g，在夏秋季達到較高水平，而非沒食子酸兒茶素類含量穩(wěn)定在21.24～23.98 mg／g，受生產(chǎn)季節(jié)的影響較小。夏秋季節(jié)覆蓋遮蔭蒸青綠茶中表型兒茶素類和沒食子酸兒茶素類含量明顯增加，這主要是由于EGC和EGCG含量的增加。

表3 不同月份所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶的兒茶素類化合物含量（mg／g）

基于8種兒茶素類化合物含量、茶多酚、游離氨基酸含量和酚氨比值，采用PCA法分析不同月份所生產(chǎn)的蒸青綠茶樣品差異，結(jié)果如圖2所示。第一主成分和第二主成分方差之和占總方差的80.7%，說明PCA分析結(jié)果能較好地反映樣品信息。得分圖（圖2A）顯示同一月份生產(chǎn)的蒸青綠茶樣品能較好地聚集在一起，且與其他月份生產(chǎn)的樣品區(qū)別開。其中，4月、5月和6月所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶位于第一主成分的正值區(qū)段，顯著區(qū)別于對照和8月所制覆蓋遮蔭樣品（位于第一主成分的負值區(qū)段）。而5月、6月、8月所制覆蓋遮蔭蒸青綠茶位于第二主成分的正值或接近于0值處，而對照和4月所制覆蓋遮蔭樣品位于第二主成分的負值區(qū)段，說明第二主成分主要體現(xiàn)了生產(chǎn)月份對蒸青茶樣品的影響。結(jié)合負載圖來看（圖2B），對照和8月份所制樣品的EGC、EC以及酚氨比值明顯高于4月、5月和6月所制蒸青綠茶樣品，這是對照和8月份所制樣品區(qū)別于其他樣品的特征指標；對照和4月份所制樣品的游離氨基酸總含量顯著高于其他月份所制樣品，而兒茶素類等含量相對較低，這是對照和4月份所制樣品區(qū)別于其他樣品的主要原因?？梢?，生產(chǎn)季節(jié)對茶樣的氨基酸含量有顯著影響，對兒茶素類含量有一定的影響，而覆蓋遮蔭在原有的基礎上進一步提高茶樣氨基酸的含量。

圖2 PCA法分析不同蒸青綠茶樣品的得分圖（A）和負載圖（B）

2.3 覆蓋遮蔭對蒸青綠茶揮發(fā)性物質(zhì)的影響

通過GC-MS分析，在五個茶葉樣品中共檢測到61種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括14種醇類物質(zhì)、13種醛類物質(zhì)、11種酮類物質(zhì)、5種酯類物質(zhì)、6種酸類物質(zhì)和12種其他類物質(zhì)。在所檢測的蒸青綠茶樣品中，醛、酮類物質(zhì)的相對含量占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的60%以上，尤以醛類物質(zhì)含量最高。香氣物質(zhì)組成中醛類和醇類物質(zhì)含量較高，占據(jù)主導地位，使得蒸青綠茶具有較強的青草味和香氣鮮、爽的特征［19］；呋喃、吡咯和吡嗪類等美拉德反應產(chǎn)物含量較低，烘焙香不明顯。圖3為不同月份蒸青綠茶樣品含有的61種揮發(fā)性物質(zhì)含量的聚類熱圖。對各揮發(fā)性物質(zhì)組分進行列均一化處理，如圖3A所示，各蒸青綠茶樣品的揮發(fā)性物質(zhì)組成較為接近。（E，E）-2，4-庚二烯醛［（2E，4E）-hepta-2，4-dienal］和正己醛（hexanal）為最主要的揮發(fā)性物質(zhì)，均屬于醛類物質(zhì)；含量較高的酮類化合物有（3E，5E）-辛-3，5-二烯-2-酮［（3E，5E）-octa-3，5-dien-2-one］，和β-紫羅蘭酮［（E）-4-（2，6，6-trimethylcyclohexen-1-yl）but-3-en-2-one］；最主要的醇類化合物有芳樟醇（3，7-dimethylocta-1，6-dien-3-ol）和1-辛烯-3-醇（oct-1-en-3-ol）；另有含量較高的酯類化合物水楊酸甲酯（diethyl benzene-1，2-dicarboxylate），酸類化合物月桂酸（dodecanoic acid），以及3種其他類化合物奧苷菊環(huán)（azulene）、吲哚（1H-indole）和1，2，4，5-四甲苯（1，2，4，5-tetramethylbenzene）。對所有樣品進行聚類分析，結(jié)果表明4月份覆蓋遮蔭蒸青綠茶的香氣組成能明顯區(qū)別于其他樣品（圖3 A）。隨著生產(chǎn)月份的往后推移，樣品的香氣組成逐漸與未遮蔭樣品接近：8月覆蓋遮蔭的綠茶的香氣物質(zhì)組成與4月份未經(jīng)遮蔭覆蓋的最接近；而6月覆蓋遮蔭的香氣，則與上述（8月覆蓋遮蔭和4月份未遮蔭覆蓋）的綠茶香氣比較接近?？梢?，覆蓋遮蔭可以改變蒸青綠茶的揮發(fā)性物質(zhì)組成，在一定程度上影響蒸青綠茶的香氣。有報道認為進行遮蔭覆蓋后的蒸青綠茶具有海苔香［20］。隨著進入夏秋季節(jié)，環(huán)境光照強度增強，覆蓋遮蔭對香氣組成的影響逐步削弱，因而夏秋季（6月、8月）覆蓋遮蔭所制蒸青綠茶的揮發(fā)性物質(zhì)組成與4月份未采取遮蔭的樣品組成接近，主要特征為（E，E）-2，4-庚二烯醛較正己醛占比高，這與4月份覆蓋遮蔭所制茶樣正好相反，而5月份覆蓋遮蔭所制茶樣具有過渡特征，（E，E）-2，4-庚二烯醛和己醛的占比相當。對各揮發(fā)性物質(zhì)組分進行行均一化處理，比較不同樣品間特定化合物含量的高低。如圖3（B）所示，4月份和5月份覆蓋遮蔭蒸青綠茶的揮發(fā)性物質(zhì)總含量較高，然后依次是8月、6月所制覆蓋遮蔭茶樣和4月未遮蔭茶樣（對照），后三個茶樣的揮發(fā)性物質(zhì)總含量差異不明顯。從不同茶樣的揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律來看，揮發(fā)性物質(zhì)的變化趨勢主要分為兩大類，4月和5月覆蓋遮蔭蒸青綠茶含量高而對照組含量低的揮發(fā)性物質(zhì)，以及對照組中含量相對更高而4月、5月遮蔭蒸青綠茶中含量低的揮發(fā)性物質(zhì)。總的來說，覆蓋遮蔭后茶樣的最主要揮發(fā)性物質(zhì)（E，E）-2，4-庚二烯醛和正己醛占比變化，以及（E，E）-2，4-庚二烯醛、吲哚、正己醛、β-紫羅酮和芳樟醇含量的提高，可能是形成覆蓋遮蔭蒸青茶樣特征香型的主要物質(zhì)基礎。有研究報道，（E，E）-2，4-庚二烯醛與茶葉的油脂味、堅果香有關［21－22］；低濃度吲哚具有花香味［23］。正己醛具有生的油脂、青草氣以及蘋果香味特征，β-紫羅酮具有強烈的紫羅蘭香味，芳樟醇具有花果香和鈴蘭香，是高級綠茶最重要的香氣成分之一［24－26］。

圖3 不同月份所制蒸青綠茶揮發(fā)性物質(zhì)含量的列均一化熱圖（A）和行均一化熱圖（B）

3 結(jié)論與展望

本文研究了覆蓋遮蔭處理以及生產(chǎn)季節(jié)對蒸青綠茶主要品質(zhì)成分的影響，包括茶多酚、游離氨基酸總含量、水浸出物、茶氨酸、咖啡堿、兒茶素類化合物和揮發(fā)性物質(zhì)含量。結(jié)果表明，覆蓋遮蔭能顯著提高蒸青綠茶游離氨基酸總含量，特別是茶氨酸的含量，對茶多酚含量影響不明顯，酚氨比值顯著降低，蒸青綠茶滋味品質(zhì)有所提高；就揮發(fā)性物質(zhì)而言，覆蓋遮蔭有助于提高蒸青綠茶揮發(fā)性物質(zhì)總量，特征香氣組分為（E，E）-2，4-庚二烯醛、正己醛、β-紫羅酮、吲哚和芳樟醇。生產(chǎn)季節(jié)對覆蓋蒸青綠茶的品質(zhì)成分有顯著影響，主要體現(xiàn)在隨著生產(chǎn)時間從4月份到8月份，游離氨基酸總含量呈明顯下降趨勢，而茶多酚含量略提高，酚氨比值大幅上升，5月所制蒸青綠茶的揮發(fā)性物質(zhì)總含量較4月略高，4月和5月所制蒸青綠茶的揮發(fā)性物質(zhì)明顯高于8月所制茶樣，6月所制茶樣的揮發(fā)性物質(zhì)含量最低，與對照茶樣無顯著差異。PCA主成分分析結(jié)果表明，蒸青綠茶茶樣可根據(jù)兒茶素類組分、茶多酚、游離氨基酸總含量以及酚氨比值進行有效區(qū)分?？偟膩碚f，4月份所制遮蔭覆蓋蒸青綠茶的氨基酸含量高，多酚含量相對較低，因而比5－8月份所制蒸青綠茶的口感更為鮮爽；而5月、8月所制遮蔭覆蓋蒸青綠茶的揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，且5月所制蒸青綠茶的滋味尚可，可利用5月、8月蒸青綠茶揮發(fā)性香氣物質(zhì)相對豐富的特性制作相應的調(diào)味茶飲料、茶食品或含茶日化產(chǎn)品等。根據(jù)所開發(fā)產(chǎn)品的特質(zhì)，如偏重口感或偏重香氣，選擇合適的生產(chǎn)季節(jié)的蒸青綠茶作為原料，實現(xiàn)茶資源的高效利用。