鄒媛媛

（杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江 杭州 312000）

胃癌是常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率居高不下。最近的國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，胃癌在男性惡性腫瘤中發(fā)病排第2 位，女性第5 位，預(yù)后相對差，整體病死率位列第3 位[1]。南方紅豆杉已被證明[2]，可抑制致癌物活化、血管生成、抗侵襲和轉(zhuǎn)移，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活率。目前已知南方紅豆杉水提物通過抑制PI3K/AKT 信號通路的激活來抑制癌細(xì)胞的侵襲，但是，南方紅豆杉的抗侵襲、轉(zhuǎn)移的特性，是否與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)還得進(jìn)一步確認(rèn)。本實驗通過體外研究，探討南方紅豆杉水提物對胃癌NCI-N87 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）功能及相關(guān)機(jī)制，報道如下。

1.資料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

HER2 陽性人胃癌NCI-N87 細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心培養(yǎng)。NCI-N87 細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱（濕度95%）條件下，培養(yǎng)于含10% FBS，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL 的RPMI1640 培養(yǎng)基中。實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：KYLL-2020-127）。

1.2 藥物

南方紅豆杉，規(guī)格8 g/包，采購自寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司。將80 g 南方紅豆杉放置于無菌容器中進(jìn)行浸泡，過夜浸泡12 h，再使用8 倍清水將其煮沸30 min，倒出藥液。將藥液放入5 倍清水中，煮沸20 min，使用真空抽濾器對藥液進(jìn)行過濾，并將其中水分蒸發(fā)至100 mL，此后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，通過水浴法將藥液濃縮至40 mL，再使用真空干燥箱對其進(jìn)行干燥，得浸膏，其濃度計算后為10.65%。取用1 g 南方紅豆杉膏狀提取物放入10 mL 超純水中，待其溶解后，使用高速冷凍離心機(jī)12 000 rpm 對其進(jìn)行離心15 min 后取上清液，再通過0.22 μm 微孔濾膜進(jìn)行除菌處理，最后制成母液濃度100 mg/mL，并置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.3 試劑及儀器

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），貯藏在2 ～8 ℃冰箱中備用?？贵w包括：E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白均購自美國Sigma Aldrich 公司。Transwell 試劑盒，采購于美國康寧，細(xì)胞侵襲浸潤試劑盒購自Millipore。本研究所有儀器設(shè)備，均有由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供。

1.4 方法

（1）造模及分組NCI-N87 細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期1×105/孔接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入轉(zhuǎn)化生長因子10 mg/L 誘導(dǎo)48 h。同時對照組選取小牛血清白蛋白子10 mg/L 誘導(dǎo)48 h，使用聚焦顯微鏡對其進(jìn)行觀察并拍照，用過觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞不再是多角形生長而是轉(zhuǎn)化為長梭形間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，且細(xì)胞多分散為單個，出現(xiàn)遷徙突觸。對照組細(xì)胞呈上皮細(xì)胞形態(tài)，形似鵝卵石，且細(xì)胞分布較為密集。采用奇偶分組法，將其分為5組，分別是空白對照組、TGF-β誘導(dǎo)組（10 mg/L）、TGF-β+（低、中、高劑量）紅豆杉組，劑量分別為（400、800、1 600 μg/mL）。（2）細(xì)胞體外遷移、侵襲實驗Transwell 小室、基質(zhì)膠和移液槍頭提前在4 ℃冰箱預(yù)冷30 min。使用無血清培養(yǎng)基對進(jìn)行1:4 稀釋，同時分別將稀釋膠50 μL緩慢加入到24-well Transwell小室中，使其將上室底部均勻鋪滿，并放置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育5 h；再將上室中殘余液體吸出，將50 μL 無血清培養(yǎng)基添加至每個小室中，溫度37 ℃，時間30 min，再吸去培養(yǎng)基。將200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室的上室每孔中，操作時要避免氣泡出現(xiàn)，并控制細(xì)胞分布均勻；600 μL 含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入至下室中，并一齊放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育；等待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)且完全貼壁，再對其進(jìn)行分組；與劃痕實驗相一致。將培養(yǎng)箱中Transwell 小室取出，去除培養(yǎng)液，使用PBS清洗3 遍；采用甲醇將膜下室細(xì)胞進(jìn)行固定30 min，并風(fēng)干小室；將600 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液滴入24 孔板中，同時將小室放入其中，確?；啄そ谌旧褐?，溫度37 ℃，時間30 min；再使用PBS 清洗3 遍，用棉簽將上室面的非侵襲細(xì)胞擦除干凈，選取100 倍顯微鏡下的5 個不同的隨機(jī)角度，對侵襲到膜下室面的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)拍照，取5 個視野下的平均數(shù)值。（3）Western blotting 法檢測EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)，將NCI-N87 細(xì)胞以30 萬/孔接種于6 孔板，用TGF-β 處理24 h，之后加入不同濃度南方紅豆杉水提物處理24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗，將蛋白提取液樣品作（聚丙烯酰胺凝膠）SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉處理后放入一抗（鼠抗人，稀釋度為1:1000）孵育2 ～3 h，洗滌緩沖液洗膜3 遍，10 min/遍左右；放入抗體稀釋濃度為1:2 500 的二抗，洗滌緩沖液洗膜3 遍，10 min/遍左右，并浸入適量比例的化學(xué)發(fā)光試劑中（A 液與B 液比例為1:1）1 min，取出后在室溫條件下進(jìn)行干燥，同時使用用保鮮膜將其包置于暗盒中，壓片曝光3 ～10 min，洗出成片，觀察相應(yīng)結(jié)果。（4）實時定量RT-PCR 將NCI-N87 細(xì)胞以30萬/孔接種于6 孔板，用TGF-β 處理24 h，之后加入不同濃度南方紅豆杉水提物處理24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS 沖洗，每孔加入Trizol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA，檢測純度，按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時內(nèi)參照物選擇管家基因β-actin mRNA，對mRNA 表達(dá)量進(jìn)行定量分析；設(shè)計相關(guān)引物時需依照GeneBank 上的基因序列，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物需要放置于瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析時選用Bio-1D 凝膠分析軟件。所有實驗均重復(fù)至少3 次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 南方紅豆杉水提物抑制TGF-β 誘導(dǎo)的NCI-N87細(xì)胞在體外劃痕、遷移和侵襲實驗

轉(zhuǎn)化生長因子組24 h 后侵襲穿膜的細(xì)胞數(shù)較空白對照組具有顯著提高；轉(zhuǎn)換生長因子中加入南方紅豆杉組24 h 后侵襲穿膜的細(xì)胞數(shù)有所減少，且中藥劑量越高，細(xì)胞數(shù)越少；轉(zhuǎn)化生長因子的誘導(dǎo)可使NCI-N87 細(xì)胞遷移和侵襲增強(qiáng)，而南方紅豆杉能夠抑制轉(zhuǎn)化生長因子對細(xì)胞遷移和侵襲能力的誘導(dǎo)作用，呈一定的劑量依賴性。

2.2 南方紅豆杉水提物抑制NCI-N87 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

與對照組相比，轉(zhuǎn)化生長因子處理后的細(xì)胞E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)增加；南方紅豆杉能抑制TGF-β 誘導(dǎo)的NCI-N87 細(xì)胞EMT，引起E-鈣黏蛋白的增加而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)抑制。

2.3 南方紅豆杉水提物通過PI3K/AKT 信號通路抑制TGF-β 誘導(dǎo)EMT

與對照組相比，TGF-β 組PI3K、Akt、p-Akt 的表達(dá)均增加；給藥后各治療組mRNA 表達(dá)與TGF-β 組相比均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性；同空白對照組相比，TGF-β+低劑量紅豆杉組高于空白對照組；TGF-β+中劑量紅豆杉組高于空白對照組；統(tǒng)計學(xué)無顯著差異；TGF-β+高劑量紅豆杉組低于空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 Real-time PCR 檢測PI3K、AKT1、mTOR 基因表達(dá)（± s）

表1 Real-time PCR 檢測PI3K、AKT1、mTOR 基因表達(dá)（± s）

組別 劑量 PI3K空白對照組 0 0.7018±0.0676 TGF-β 組 10 mg/L 0.9901±0.3977 TGF-β+低劑量紅豆杉組 10 mg/L+400 μg/mL 0.9683±0.1323 TGF-β+中劑量紅豆杉組 10 mg/L+800 μg/mL 0.7616±0.0112 TGF-β+高劑量紅豆杉組 10 mg/L+1 600 μg/mL 0.5234±0.0386組別 AKT1 mTOR空白對照組 0.612±0.0753 0.5013±0.1182 TGF-β 組 1.2286±0.1675 1.0532±0.0158 TGF-β+低劑量紅豆杉組 1.0858±0.1456 0.8172±0.0674 TGF-β+中劑量紅豆杉組 0.8018±0.3867 0.6926±0.0678 TGF-β+高劑量紅豆杉組 0.5656±0.1778 0.4162±0.0652

3.討論

胃癌5 年生存率和預(yù)后差的主要原因是腫瘤能夠浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、遠(yuǎn)端組織以及周圍組織，大部分胃癌或胃食管結(jié)合部癌患者在診斷時已為進(jìn)展期、轉(zhuǎn)移晚期或不可手術(shù)階段，預(yù)后較差。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），由上皮細(xì)胞脫黏附轉(zhuǎn)變成有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞，主要作用于胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)機(jī)理。據(jù)相關(guān)研究分析[3]，多種細(xì)胞外信號可使上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化得到激發(fā)，包括細(xì)胞膠原、透明質(zhì)酸，多種可溶性生長因子等，均能對EMT誘導(dǎo)信號通路產(chǎn)生激活作用。包括TGF信號通路、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）通路以及Notch 通路等。轉(zhuǎn)化生長因子屬于EMT 誘導(dǎo)因子的一種，除對經(jīng)典Smad 依賴的信號通路進(jìn)行激活外，還能使多條EMT 非經(jīng)典信號通路得到激活，包括Ras/MAPK、PI3K/AKT 等信號通路，進(jìn)而促使上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生[4]。腫瘤細(xì)胞生長因子EGF、VEGF 表達(dá)上調(diào)依賴于TGF-β誘導(dǎo)，其作為細(xì)胞外刺激信號通過激活PI3K/AKT 通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[5]。實驗表明，TGF-β 誘導(dǎo)胃癌NCI-N87 細(xì)胞后可激活PI3K/AKT 通路促進(jìn)胃癌NCI-N87細(xì)胞EMT 和轉(zhuǎn)移。本實驗通過加入轉(zhuǎn)化生長因子刺激NCI-N87 胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，對南方紅豆杉水體物抑制PI3K/AKT 信號通路調(diào)控以及逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生進(jìn)行分析。

南方紅豆杉性平、味甘、入肺、胃、大腸經(jīng)，具有軟堅散結(jié)的功效[5]。南方紅豆杉在我國分布最為廣泛，據(jù)相關(guān)研究表明，紅豆杉中包含紫杉醇、紫杉黃酮、小分子類物質(zhì)（鞣質(zhì)）、紅豆杉多糖、等40 多種有效成分[6]。紅豆杉提取物的主要作用原理是對腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和HEp-2 進(jìn)行誘導(dǎo)，使其凋亡，從而對腫瘤細(xì)胞生長起到抑制作用；同時促進(jìn)合成干擾素、腫瘤壞死因子以及白介素-2 等細(xì)胞因子；并使T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞得到激活，從而使抗體與補(bǔ)體免疫功能提高。南方紅豆杉具有抑制人HER2 陽性胃癌NCI-N87 細(xì)胞生長的作用，能夠使其繁殖受阻，進(jìn)而死亡。南方紅豆杉水提物能夠抑制HER2 陽性裸鼠移植瘤生長，并將其殺死，同時還可以阻礙胃癌細(xì)胞成長，但是其對NCI-N87 胃癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是否有逆轉(zhuǎn)作用尚需進(jìn)一步研究。

本文結(jié)果顯示南方紅豆杉能通過PI3K/AKT 信號通路抑制TGF-β 誘導(dǎo)的EMT，進(jìn)而減弱NCI-N87 細(xì)胞侵襲遷移能力。本研究明確了南方紅豆杉抑制人胃癌NCI-N87細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用與PI3K/AKT 信號通路有關(guān)，但是PI3K/AKT 信號通路家族成員眾多，對此信號通路作用靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步的研究。