王紅戟 杞斯卡娜 保志鵬 王榮平 朱興貴 薛杰

摘要：干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專能干細(xì)胞。其中專能干細(xì)胞只能在某一特定的組織器官應(yīng)用中修復(fù)一種組織。本次試驗(yàn)，基于骨干細(xì)胞治療骨疾病的應(yīng)用研究，36只試驗(yàn)兔子構(gòu)建動(dòng)物模型。將試驗(yàn)兔分為2組進(jìn)行試驗(yàn)。其中一個(gè)組使用干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，另一個(gè)對(duì)照組未使用。結(jié)果證明：干細(xì)胞分泌因子在相同動(dòng)物的骨損傷上的應(yīng)用呈顯著差異性，有修復(fù)骨細(xì)胞功效。通過(guò)本次試驗(yàn)說(shuō)明了干細(xì)胞分泌因子在骨修復(fù)臨床應(yīng)用上有一定效果。

關(guān)鍵詞：干細(xì)胞分泌因子、專能干細(xì)胞、0.5 ml甲基纖維素凝膠、動(dòng)物模型

前言

這些成年干細(xì)胞已得到廣泛的研究并在醫(yī)療上有所應(yīng)用。蔣桃[1]等人用犬做過(guò)研究。蔣桃的試驗(yàn)方法：采用12只幼年中華田園犬，按幼犬免疫和驅(qū)蟲程序進(jìn)行免疫、驅(qū)蟲后進(jìn)行全面體檢合格后作試驗(yàn)犬。在每只試驗(yàn)犬背部作3個(gè)30mm*30mm皮膚損傷模型，結(jié)論：干細(xì)胞分泌因子治療創(chuàng)面愈合速度明顯提高，顯著縮短療程，創(chuàng)面肉芽組織、血管、汗腺、毛囊等生長(zhǎng)更好。研究結(jié)果表明，采用干細(xì)胞分泌因子修復(fù)犬皮膚損傷（包括車禍、皮膚病、外科損傷）具有良好效果，能加快修復(fù)皮膚速度 。作者采用36只兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18只，構(gòu)建動(dòng)物模型。其中一個(gè)組使用干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液，另一個(gè)對(duì)照組未使用。試驗(yàn)從干細(xì)胞分泌物因子在實(shí)驗(yàn)兔骨損傷的應(yīng)用，對(duì)動(dòng)物骨病治療方面提供生物制劑治療提供依據(jù)。

一、干細(xì)胞分泌因子相關(guān)內(nèi)容

（一）干細(xì)胞分泌因子的概念：

1、干細(xì)胞分泌因子的概念

是指那些未分化的、因而有可能分化成不同類型細(xì)胞的細(xì)胞，具有自我更新，高度分化的細(xì)胞。

2、干細(xì)胞分泌因子的來(lái)源

2.1干細(xì)胞按其功能分化分為全 能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和專能干細(xì)胞。全能干細(xì)胞可以形成完整組織器官;多能干細(xì)胞可以用于血管，軟組織的修復(fù);專能干細(xì)胞是只能形成一種組織。[2]

3、課題研究的目的

成年實(shí)驗(yàn)兔干細(xì)胞分泌因子動(dòng)物模型已得到廣泛研究并為醫(yī)療上應(yīng)用提供依據(jù)。本次研究基于專能干細(xì)胞的應(yīng)用。

（二）干細(xì)胞分泌因子的研究路徑設(shè)想

在寵物臨床診療時(shí)，發(fā)現(xiàn)寵物在治療組織器官損傷時(shí)，骨骼組織的損傷手術(shù)過(guò)程繁瑣，醫(yī)療費(fèi)用較高，后遺癥嚴(yán)重，希望用干細(xì)胞修復(fù)組織器官能力修復(fù)骨骼，動(dòng)物能夠痊愈，并且減少后遺癥。故采用試驗(yàn)動(dòng)物兔子進(jìn)行試驗(yàn)。

二、材料方法

1、藥物試劑及設(shè)備

500ml生物化學(xué)制品*Biological Industries，?1g/支甲基纖維素，10%水合氯醛2 ml，辛伐他汀乙醇。4 ℃冰箱，磁力攪拌器，180升烤箱

2、實(shí)驗(yàn)對(duì)象

36只成年雄性新西蘭大耳白兔（體重2-3 kg，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），所有實(shí)驗(yàn)兔均在清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)[3]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，本次實(shí)驗(yàn)材料使用的是體外干細(xì)胞增殖分化為干細(xì)胞分泌因子，沒有殺傷動(dòng)物的方法試驗(yàn)，所以符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

36只兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18只。其中18只不做處理，作為①對(duì)照組;[4]行單側(cè)（左上肢）岡上肌肩袖組織撕裂修補(bǔ)術(shù)，另外18只作為②實(shí)驗(yàn)組;行單側(cè)（左上肢）岡上肌肩袖組織撕裂修補(bǔ)術(shù)，同時(shí)給予干細(xì)胞分泌因子。術(shù)后所有兔均按標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)并分別于術(shù)后14天，28天，56天各處死6只兔子，留取手術(shù)部位局部標(biāo)本[5]，進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)和組織學(xué)觀察，觀察比較兩種模型愈合過(guò)程中的相似程度。對(duì)照組不做處理，觀察在相同條件下自然發(fā)病的臨床癥狀。使用自己制備的干細(xì)胞分泌因子。[5]

3、手術(shù)方式

3.1常規(guī)飼養(yǎng)7天，開始做動(dòng)物模型，確認(rèn)飲食活動(dòng)正常，用直徑為0.8 mm的克氏針自骨槽內(nèi)側(cè)向肱骨大結(jié)節(jié)外側(cè)皮質(zhì)鉆兩個(gè)骨孔，用絲線縫合穿過(guò)骨孔將岡上肌肌腱斷端拉回骨槽[4]。

3.3在打結(jié)固定前，實(shí)驗(yàn)組在骨槽內(nèi)注入 0.5 ml干細(xì)胞分泌因子/甲基纖維素凝膠;【4引證】

3.4對(duì)照組注入 0.5 ml甲基纖維素凝膠，逐層縫合切口。

4.4西安百奧普生物有限公司進(jìn)行。干細(xì)胞分泌因子修復(fù)液由該公司提供。試驗(yàn)使用在云南昆明某試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)完成。

5、檢測(cè)方法

5.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集

5.1.1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兔子于術(shù)后第14、28、56天各處死6只，以岡上肌止點(diǎn)為中心，截除近端的肩胛骨和遠(yuǎn)端肱骨，僅保留岡上肌腱與近端肱骨，剔除其余軟組織，用浸過(guò)生理鹽水的濕紗布包裹后行生物力學(xué)測(cè)試，測(cè)試完畢后，將標(biāo)本浸泡在10%的中性福爾馬林溶液中，4 ℃冰箱保存。[5]

5.2生物力學(xué)測(cè)試

將標(biāo)本同定在Instron 3300電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，每個(gè)標(biāo)本先以6N的拉力預(yù)處理1分鐘，然后以載荷率為5 mm/min行拉斷試驗(yàn)，測(cè)量最大載荷與剛度。

5.3 組織學(xué)染色

5.3.1將生物力學(xué)測(cè)試完的標(biāo)本置于10%多醛溶液固定24 h后EDTA脫鈣，然后再經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，沿腱一骨界面縱軸切片，制成4 μm厚的切片，術(shù)后14、28、56天進(jìn)行HE染色和甲苯胺藍(lán)染色，觀察軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的含量。[6]

5.3.2 HE染色操作。用蠟筆在血膜兩頭畫線，以防染液溢出。然后將血涂片平放在染色架上。[9]用瑞氏染液3～5滴覆蓋整個(gè)血膜固定細(xì)胞0.5～1 min。滴加等量或稍多的緩沖液，用洗耳球?qū)⑵渑c染液吹勻，染色5～10 min。慢慢搖動(dòng)玻片，然后用流動(dòng)水從玻片的一側(cè)沖去染液，待血涂片自然干燥后（或用濾紙吸干），即可鏡檢。加藍(lán)流由天青-伊紅組成，對(duì)細(xì)胞核著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更清[9]。

5.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，該方法是目前通用的的生物統(tǒng)計(jì)方法，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05驗(yàn)證差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[7]

三、結(jié)果

1一般結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中動(dòng)物在術(shù)后出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙，手術(shù)側(cè)肢體活動(dòng)失調(diào)的情況，其中有一部分兔局部組織感染化膿的現(xiàn)象（感染率約5%）;飲食無(wú)明顯變化，體重?zé)o明顯變化。

對(duì)照組有化膿性滑膜炎，臨床癥狀為跛行，觸摸肩關(guān)節(jié)腫脹，髖關(guān)節(jié)不易觸摸。

2對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室血常規(guī)結(jié)果表1-2[8]

3對(duì)照組臨床檢查?表1-2[8]

4發(fā)病原理：

化膿的體溫升高的原因是由炎癥引起的，表現(xiàn)為粘膜充血、水腫和出血，并被覆多量黃白色膿樣分泌物。

5組織切片染色結(jié)果

5.1取第56天骨做骨組織切片，同時(shí)進(jìn)行組織切片HE和Masson染色。HE染色觀察：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色。Masson染色觀察：膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、細(xì)胞質(zhì)、纖維素、角蛋白和紅細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。[10]

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后56天，實(shí)驗(yàn)組肌腱與骨結(jié)合緊密，肌腱膠原纖維粗大規(guī)則，與正常的腱骨界面結(jié)構(gòu)相似;

5.3對(duì)照組腱骨間隙模糊，膠原纖維連接紊亂。

5.4生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果，如下表

四、結(jié)論：

1、通過(guò)本次試驗(yàn)證明干細(xì)胞分泌因子在相同動(dòng)物的骨損傷上的應(yīng)用呈顯著差異性，有修復(fù)骨細(xì)胞功效。

2、通過(guò)本次試驗(yàn)解決干細(xì)胞分泌因子在骨修復(fù)臨床應(yīng)用上有一定效果。因?yàn)楦杉?xì)胞分泌因?qū)儆谧泽w細(xì)胞，最具活力，最具影響力，未來(lái)干細(xì)胞分泌因子可以解決動(dòng)物骨壞死的新型治療方法。

3、安全性由于采用體外復(fù)制技術(shù)，已具備自體細(xì)胞移植能力，對(duì)傳統(tǒng)治療的一種革命。

4、在骨損傷修復(fù)過(guò)程中創(chuàng)口愈合期最少14天能夠愈合。所以設(shè)置時(shí)間分別為14天、28天、56天。說(shuō)明骨損傷愈合效果，用藥時(shí)間越長(zhǎng)，愈合效果越好。

五、干細(xì)胞研究前景

1、干細(xì)胞分化為誘導(dǎo)分化細(xì)胞注射到動(dòng)物機(jī)體，沒有形成腫瘤，說(shuō)明對(duì)疾病治療是安全的。

2、成年干細(xì)胞也具有一定的可塑性，形成個(gè)體發(fā)育機(jī)制的材料

3、研究新藥開發(fā)，直接用于疾病治療，如骨干細(xì)胞分泌在兔機(jī)體形成骨組織修復(fù)骨損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣桃，犬干細(xì)胞分泌因子對(duì)皮膚損傷修復(fù)的應(yīng)用研究[D];云南農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年 [1]

[2]斐雪濤、干細(xì)胞生物學(xué)，科學(xué)出版社，2003;4-15

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS233-2002）對(duì)生物安全三級(jí)（P3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了規(guī)定《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》。 2015年7月6日

[4]李肯、于騰波等，辛伐他汀作兔肩袖損傷修復(fù)術(shù)骨腱-骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志 2019年1月

[5]陳喆（導(dǎo)師：汪益民），中國(guó)人民解放軍海軍愈合模型的比較?2019年6月

[6]任俊玲，血液常規(guī)檢驗(yàn) ， 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷（第1版）[D]中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社?2019年 [24頁(yè)]

[7]目前國(guó)內(nèi)通用的試驗(yàn)技術(shù)方法。

[8]簡(jiǎn)載華， 獸醫(yī)手冊(cè)[D]（第3版）江西科學(xué)技術(shù)出版社 2000年[20頁(yè)]

[9]任俊玲?獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷 [D]?（第1版）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社

致謝感謝西安百奧普生物科技公司為本次試驗(yàn)提供試劑、試驗(yàn)材料、檢測(cè)。