洪森榮，余淑鈴，曾欣怡，趙海玲，鄭怡婷，周 軍，朱金晶，朱麗倩，蔡 紅，陳榮華，

（1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒334001；2.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西 上饒334700）

馬鈴薯在世界上是僅次于水稻、小麥、玉米的第4大糧食作物[1].高山馬鈴薯具有食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、種植成本和栽培技術(shù)要求低的優(yōu)點(diǎn)，且高山馬鈴薯適應(yīng)高海拔環(huán)境能力強(qiáng)，對(duì)高山土壤的肥力、酸堿度、坡度、濕度以及光照等逆境脅迫容易耐受，可在山區(qū)、丘陵緩坡進(jìn)行大面積推廣種植[2].因此，高山馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)化潛力優(yōu)勢(shì)十分明顯.懷玉山高山馬鈴薯，俗名麻籽洋芋，是上饒市玉山縣懷玉山鄉(xiāng)國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)十分全面，且不含還原糖，適合“高血脂、高血壓、高血糖”三高人群食用，藥食兼優(yōu)[3].懷玉山高山馬鈴薯與其他高山馬鈴薯不同之處在于該物種只能適合于高山高海拔地區(qū)種植，一旦將其移種于平原地區(qū)，將會(huì)產(chǎn)生變種現(xiàn)象，外形變大，品質(zhì)和風(fēng)味與原有品種相差甚遠(yuǎn).

本課題組對(duì)懷玉山高山馬鈴薯正常種及其變種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄本在正常種中上調(diào)，在變種中下調(diào)，其qRT-PCR檢測(cè)也進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準(zhǔn)確性，說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄本響應(yīng)逆境脅迫.通過(guò)克隆、序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本編碼脅迫相關(guān)蛋白（stress related protein）.為了更深入了解懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白基因的功能，本研究克隆了該蛋白的基因，并對(duì)其蛋白序列進(jìn)行了分析，為深入研究該基因參與懷玉山高山馬鈴薯抗逆調(diào)控的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試劑：M-MLVcDNA第一鏈合成試劑、PrimeScriptRT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）、PMD18-T vector及SYBRPremix Ex TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司；Gel Extraction Kit，美國(guó)Omega公司；Trizol總RNA提取試劑、PCR反應(yīng)2×GoldStarTaq-MasterMix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

用Trizol試劑提取懷玉山高山馬鈴薯試管苗的總RNA，參照文獻(xiàn)[3]，對(duì)濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè).以RNA為模版，按照M-MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書合成cDNA第一鏈，以O(shè)ligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′為逆轉(zhuǎn)錄引物，具體操作參照說(shuō)明書.

1.2.2 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白基因的克隆

從試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到脅迫相關(guān)蛋白基因的核心片段，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因特異性引物（F：ATGGCCGAAACAAACCCTAAG；R：TTAGCTGGAAGCCACAGGCTG）.PCR擴(kuò)增條件：95℃2 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min.用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體進(jìn)行連接，采用熱激法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，對(duì)鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序.

1.2.3 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白基因的生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[4]中的方法，分析懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白的氨基酸序列和理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)，分析進(jìn)化關(guān)系.使用BioEdit軟件將基因序列翻譯為氨基酸序列，用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)，用ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預(yù) 測(cè) 蛋 白疏/親水性.使用GORIV軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu).使用SWISS-MOLD（http：//www.swissmodel.expasy.org/interac）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 脅迫相關(guān)蛋白基因的cDNA序列

正好，在“第二次寧都會(huì)議”結(jié)束后，毛澤東重返瑞金，途經(jīng)大柏地時(shí)巧遇了一場(chǎng)大雨。雨過(guò)天晴，在斜陽(yáng)輝映下，一碧如洗的天空懸掛著一抹絢麗的彩虹；碧空下的群山延綿起伏、蒼翠欲滴。開闊壯美的景象激蕩著毛澤東的內(nèi)心。古語(yǔ)云“不平則鳴，以舒其憤”，富有文學(xué)才情和詩(shī)人氣質(zhì)的毛澤東，瞬間把心中的塊壘化作充滿浪漫色彩的“天問(wèn)”：“赤橙黃綠青藍(lán)紫，誰(shuí)持彩練當(dāng)空舞？”詞的開篇以反詰的語(yǔ)氣發(fā)問(wèn)，極具強(qiáng)烈的感情色彩，暢快地釋放了作者心底的情緒。這首詞就是在這樣的內(nèi)因驅(qū)動(dòng)和外因誘導(dǎo)下寫就的，不僅使作者達(dá)到新的心理平衡，而且令作者的心境更加開闊、高遠(yuǎn)。

懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白基因的cDNA總長(zhǎng)度為681 bp，具體堿基組成如圖1（a）所示，各堿基的比例如圖1（b）所示，G+C含量為47.58%.

圖1 脅迫相關(guān)蛋白基因的cDNA序列分析Fig.1 Analysis on cDNA consequence of stress related protein gene

2.1.2 脅迫相關(guān)蛋白的氨基酸序列

利用ProtParam預(yù)測(cè)懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白的氨基酸序列，結(jié)果如圖2所示.

圖2 脅迫相關(guān)蛋白的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of the stress related protein

由圖2可以看出，懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白由226個(gè)氨基酸組成.該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為24 781.71，等電點(diǎn)為9.16，是親水性蛋白.各氨基酸的數(shù)目和比例：Ala（A）（29，12.8%）、Arg（R）（6，2.7%）、Asn（N）（4，1.8%）、Asp（D）（5，2.2%）、Cys（C）（1，0.4%）、Gln（Q）（13，5.8%）、Glu（E）（16，7.1%）、Gly（G）（10，4.4%）、His（H）（2，0.9%）、Ile（I）（5，2.2%）、Leu（L）（11，4.9%）、Lys（K）（21，9.3%）、Met（M）（7，3.1%）、Phe（F）（6，2.7%）、Pro（P）（18，8.0%）、Ser（S）（12，5.3%）、Thr（T）（13，5.8%）、Trp（W）（1，0.4%）、Tyr（Y）（14，6.2%）、Val（V）（32，14.2%）、Pyl（O）（0，0%）、Sec（U）（0，0%）.帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為21，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為27.原子組成：碳（C）1 125，氫（H）1 779，氮（N）287，氧（O）325，硫（S）8.分子式為C1125H1779N287O325S8，原子總數(shù)為3 524.

2.1.3 脅迫相關(guān)蛋白的親、疏水性分析

對(duì)懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白進(jìn)行親、疏水性分析，結(jié)果如圖3所示.圖中高峰值（正值）表示疏水區(qū)域，低谷（負(fù)值）表示親水區(qū)域.由圖3可以看出，脅迫相關(guān)蛋白的最大疏水值約為2.5，說(shuō)明該處的疏水性最強(qiáng)，親水峰最大值約為-2.5.總平均親水性為-0.157.因此，蛋白質(zhì)整體呈現(xiàn)高度親水性，即為親水性蛋白質(zhì).

圖3 脅迫相關(guān)蛋白親、疏水值分布Fig.3 Distribution of relative and sparse water values of the stress related protein

2.2 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用GOR IV軟件對(duì)懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（alpha helix，42.48%）、β-片層（extended strand，15.93%）、無(wú)規(guī)則卷曲（random coil，41.59%）構(gòu)成.從分布位點(diǎn)來(lái)看，C端含無(wú)規(guī)則卷曲，N端含β-片層和無(wú)規(guī)則卷曲，無(wú)規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋也散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中.

圖4 脅迫相關(guān)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of the stress related protein

2.3 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)為二聚體.

圖5 脅迫相關(guān)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of the stress related protein

2.4 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白亞細(xì)胞定位

利用Psort在線軟件對(duì)脅迫相關(guān)蛋白基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示.

圖6 脅迫相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of the stress related protein

由圖6可知，定位于細(xì)胞核中的脅迫相關(guān)蛋白基因數(shù)量為4個(gè)，葉綠體中為3個(gè)，細(xì)胞質(zhì)中為3個(gè)，線粒體中為2個(gè)，細(xì)胞外為2個(gè).這表明該蛋白主要存在于細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞外.

2.5 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

構(gòu)建懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白的進(jìn)化樹，結(jié)果如圖7所示.由圖7可以看出，懷玉山高山馬鈴薯與馬鈴薯（Solanum tuberosum）脅迫相關(guān)蛋白（stress related protein）、野生種潘那利番茄（Solanum pennellii）類脅迫相關(guān)蛋白（stress related protein-like）、野生種潘那利番茄脅迫相關(guān)蛋白亞型X2（stress related protein isoform X2）、野生種潘那利番茄脅迫相關(guān)蛋白亞型X1（stress related protein isoform X1）、智利番茄（Solanum chilense）假設(shè)蛋白EJD97008208（hypothetical protein EJD97008208）、番茄（Solanum lycopersicum）類REF/SRPP蛋白At3g-05500亞型X1（REF/SRPP-like protein At3g-05500 isoform X1）在一個(gè)大分支下，這說(shuō)明懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白在進(jìn)化上與馬鈴薯、野生種潘那利番茄、智利番茄和番茄的親緣關(guān)系較近，尤其是與馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近.

圖7 脅迫相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of the stress related protein

2.6 懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白同源蛋白的序列比對(duì)信息

懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白同源蛋白的序列比對(duì)信息如圖8所示.圖中※號(hào)區(qū)域是該蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域.

圖8 脅迫相關(guān)蛋白同源蛋白的序列比對(duì)Fig.8 Sequence alignment of homologous proteins of stress related protein

3 討論與結(jié)論

目前脅迫相關(guān)基因（如感受和傳導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶）、轉(zhuǎn)錄因子（由信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控基因表達(dá)）以及一些提高植物抗性的功能基因的研究較多[5].研究表明，許多基因受各種逆境脅迫（干旱、低溫、高鹽等）誘導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生一些重要的功能蛋白和調(diào)控蛋白，這些功能蛋白和調(diào)控蛋白對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)的維持具有重要意義[6].如OsiSAP8是一個(gè)能夠被高溫、低溫、高鹽、干旱、澇、傷害、重金屬和ABA誘導(dǎo)的基因，能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草和水稻的逆境抗性[7]；NPK1過(guò)表達(dá)可激活一個(gè)氧化信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高轉(zhuǎn)基因玉米的逆境抗性[8]；擬南芥耐鹽蛋白（STO）是一種對(duì)酵母細(xì)胞具有耐鹽性的蛋白質(zhì)，在擬南芥植株光敏色素和藍(lán)光信號(hào)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，并參與了黃化過(guò)程中苯基苯乙烯酮合酶（CHS）表達(dá)的調(diào)控[9].本研究中，懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白基因cDNA總長(zhǎng)度為681bp，G+C含量為47.58%，脅迫相關(guān)蛋白由226個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為24 781.71，等電點(diǎn)為9.16，是親水性蛋白.懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（42.48%）、β-片層（15.93%）、無(wú)規(guī)則卷曲（41.59%）構(gòu)成，C端含無(wú)規(guī)則卷曲，N端含β-片層和無(wú)規(guī)則卷曲，且無(wú)規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中.三級(jí)結(jié)構(gòu)為二聚體.懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白主要存在于細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞外.

蛋白質(zhì)的生物合成需要起動(dòng)因子、延伸因子、終止因子、核糖體、信使RNA、氨酰合成酶和tRNA等多種生物大分子的協(xié)同作用[10].存在于真核細(xì)胞內(nèi)的延伸因子，其功能是催化氨基酸鏈在核糖體上的延伸，是一個(gè)重要的翻譯因子，表達(dá)調(diào)控保守，其表達(dá)水平與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂相關(guān)[11].延長(zhǎng)因子是可誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，逆境脅迫可誘導(dǎo)延長(zhǎng)因子基因的表達(dá)[12].本研究構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，懷玉山高山馬鈴薯與馬鈴薯的脅迫相關(guān)蛋白、野生種潘那利番茄的類脅迫相關(guān)蛋白、脅迫相關(guān)蛋白亞型X2和亞型X1、智利番茄假設(shè)蛋白EJD97008208、番茄類REF/SRPP蛋白At3g05500亞型X1在一個(gè)大分支下，與馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系最近，且與番茄類REF/SRPP蛋白At3g-05500亞型X1功能相似.橡膠粒子可合成與貯存天然橡膠，一般有小橡膠粒子（small rubber particles，SRPs）和大橡膠粒子（large rubber particles，LRPs）之分.橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）和小橡膠粒子蛋白（SRP protein，SRPP）為橡膠粒子的膜蛋白，是橡膠生物合成的關(guān)鍵蛋白[13].經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，REF和SRPP均屬植物脅迫相關(guān)蛋白R(shí)EF家族[14]，同源性達(dá)72%，具有保守的REF結(jié)構(gòu)域，REF家族成員在多種植物中都有發(fā)現(xiàn)，是一類脅迫相關(guān)蛋白，表達(dá)受一些外界刺激或激素的調(diào)控，在抵御逆境脅迫的生理過(guò)程中可能具有重要功能[15-17].懷玉山高山馬鈴薯與馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白可能屬于類REF/SRPP蛋白，在高山高海拔生境中可能作為某種抗逆蛋白發(fā)揮作用.懷玉山高山馬鈴薯高山正常種與平原變種的轉(zhuǎn)錄組分析也證明懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白基因在高山正常種中上調(diào)，在平原變種中下調(diào).說(shuō)明懷玉山高山馬鈴薯脅迫相關(guān)蛋白在植物抵御逆境脅迫的生理反應(yīng)中起著重要作用.