李婷婷，王丹丹，盧曉琦，吳發(fā)明，姚秋陽

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563000)

硒(Selenium,Se)是人體所必需的微量元素之一.適量硒的攝入對(duì)維護(hù)身體健康具有重要作用[1],它可以增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、預(yù)防癌癥、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和預(yù)防心血管[2-3].世界衛(wèi)生組織建議正常成年人每天硒的攝入量為50～400 μg(中國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 578.3-2017).有研究顯示：人體缺硒會(huì)導(dǎo)致一些慢性疾病如克山病、大骨節(jié)病等[4]，而過量攝入也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病、慢性脫發(fā)、皮膚損傷等，嚴(yán)重者還可能導(dǎo)致直接死亡，可見，適當(dāng)攝入硒元素至關(guān)重要[3-4].因此測(cè)定食品或藥材中的硒元素對(duì)食品和藥品的安全和質(zhì)量評(píng)價(jià)非常重要.

硒含量的測(cè)定方法包括氫化物-原子熒光光譜法(AFS)、原子吸收光譜法(AAS)、紫外可見分光光度法(UV-Vis)、高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[5-8].原子吸收光譜法有嚴(yán)重的基體干擾和靈敏度低等缺點(diǎn)；而熒光法雖然準(zhǔn)確但操作繁瑣，這兩種方法均有不足之處.氫化物原子熒光光譜法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度、精密度好，線性范圍寬，所用試劑毒性小，實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[9-10].現(xiàn)行的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定(GB5009.93—2017)中氫化物原子熒光光譜法是檢測(cè)食品中硒元素的首選方法.其基本原理是：樣品經(jīng)消化后，在6 mol·L-1鹽酸介質(zhì)中，將試樣中的Se6+還原成Se4+，在硼氫化鈉或硼氫化鉀的作用下將四價(jià)硒在鹽酸介質(zhì)中還原成硒化氫[11]，硒化氫原子化后可在硒空心陰極燈照射下，在去活化回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出特征波長(zhǎng)的熒光，能與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量.

快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定硒含量是研究富硒中藥材的關(guān)鍵技術(shù)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)旨在利用氫化物-原子熒光光譜法準(zhǔn)確測(cè)定黨參的硒含量，以為富硒黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定方法學(xué)基礎(chǔ).

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材

供試11批黨參藥材來自四川成都荷花池藥材市場(chǎng)，由遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院吳發(fā)明副教授鑒定為黨參.

1.2 試劑

硒酸鈉(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)；硼氫化鈉(上海泰坦科技股份有限公司)；鹽酸分析純(重慶川東化工有限公司)；硝酸分析純(成都市科龍化工試劑廠)；高氯酸分析純(成都市科龍化工試劑廠)；硫酸分析純(成都市科龍化工試劑廠)；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心).

1.3 儀器

BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；PHS-25型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；101-4A電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；AFS-8800雙道原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器公司)；超純水機(jī)(德國(guó)默克密理博有限公司).

2 方 法

2.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

1 mg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取1 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1)用蒸餾水定容至1 000 mL.

還原劑硼氫化鈉堿溶液(8 g·L-1)：稱取5 g氫氧化鈉于100 mL干凈的小燒杯內(nèi)，加入50 mL超純水，溶解，再加入8 g硼氫化鈉，溶解完成后，將溶液轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，充分搖勻，用蒸餾水定容.

載流液鹽酸溶液(5+95)：量取25 mL鹽酸，緩慢加入475 mL水中，混勻.

2.1.2 樣品前處理

第2 d在加熱板上加熱(140～180 ℃，低于200 ℃)，并根據(jù)需要及時(shí)添加硝酸.當(dāng)溶液為澄清無色并伴有白色煙霧時(shí)，開始趕酸(220～250 ℃)至剩余體積為1～2 mL，不可蒸干.冷卻后加入6 mol·L-1的鹽酸溶液5 mL，并繼續(xù)加熱直至溶液澄清無色，并伴有大量白煙(160 ℃，15 min).冷卻后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加入2.0 mL濃鹽酸，用蒸餾水定容，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)，所有試樣均4 ℃保存?zhèn)洳?移取10.0 mL試樣消化液于15 mL離心管中，加入濃鹽酸2.0 mL，鐵氰化鉀溶液1.0 mL，混勻后放置2 h待測(cè).采用原子熒光光譜法測(cè)定硒含量，每個(gè)處理組測(cè)量3次取平均值.

2.2 儀器條件

采用原子熒光光譜法測(cè)定黨參中硒元素含量的定量分析方法，主要參數(shù)如下：負(fù)高壓270 V；燈電流70 Ma；原子化溫度800 ℃；爐高8 mm；載氣流速500 mL·min-1；讀數(shù)方式：峰面積；讀數(shù)時(shí)間15 s；加液時(shí)間8 s；進(jìn)樣體積2 mL；測(cè)量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制備的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、1.00、2.00和4.00 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度.該硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0、5.00、10.00、20.00和40.00 μg·L-1.以上標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性考察

將儀器參數(shù)調(diào)至最佳工作狀態(tài)，分別對(duì)0、5、10、20、40 μg·L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)濃度3次重復(fù)，記錄熒光強(qiáng)度測(cè)量值，取算術(shù)平均值后，按線性回歸法求出工作曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2.

2.4.2 檢出限

將儀器參數(shù)調(diào)至最佳工作狀態(tài)，用硼氫化鈉作為還原劑分別對(duì)0、5、10、20、40 μg·L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，記錄熒光強(qiáng)度測(cè)量值，取算術(shù)平均值后，按線性回歸法求出斜率k.將“2.3”項(xiàng)下制備的0 μg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行11次硒含量測(cè)量，記錄其熒光強(qiáng)度，求出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差S0，按下式計(jì)算出檢出限Q.按照2009版《中華人民共和國(guó)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程》，Q≤0.4 ng·mL-1.

Q=3S0/k.

(1)

2.4.3 加樣回收實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取9份0.5 g黨參樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下操作進(jìn)行消化，同時(shí)制備空白對(duì)照，后向樣品消化液中加入適量硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含硒加入濃度分別為低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液(分別相當(dāng)于原待測(cè)樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%、120%).每個(gè)濃度平行配制3份，記錄硒熒光強(qiáng)度值(A)，計(jì)算硒熒光強(qiáng)度值(ΔA=A-A0)，根據(jù)下列公式計(jì)算回收率.

回收率(%)=(測(cè)定總量-硒含量)/加入量*100 .

(2)

2.4.4 精密度試驗(yàn)和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)中取10 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣7次，在擬定的條件下進(jìn)行硒含量測(cè)定，記錄硒濃度值，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值.準(zhǔn)確度試驗(yàn)中對(duì)同一份黨參樣品進(jìn)行硒含量測(cè)定6次.計(jì)算其硒含量平均值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值.

RSD(%)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均值*100 .

(3)

(4)

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制黨參樣品和空白組織樣品置于錐形瓶中，后按“2.1.2”項(xiàng)下操作處理進(jìn)行原子熒光分析，分別在0、20、40、60、80、100 min按上述儀器條件進(jìn)行含量測(cè)定，記錄熒光強(qiáng)度值.

2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)及LSD和Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析(P<0.05)，所得統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用Graphpad prism進(jìn)行圖形繪制.

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系考察與檢出限

線性考察結(jié)果如圖1所示.

濃度/(μg·L-1)圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

硒含量在0～40 μg·L-1質(zhì)量范圍內(nèi)與其熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好，回歸方程為y=57.371x+18.201(R2=0.999 9).檢出限為Q=0.065 ng·mL-1，符合JJJ 939—2009《中華人民共和國(guó)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程》要求(≤0.4 ng·mL-1).

3.1.2 加樣回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)照品溶液的加樣回收率平均值為113.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.97%，說明方法具有較好的精密度.符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求(60%～120%).結(jié)果見表1.

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.3 精密度試驗(yàn)和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

選用10.0 μg·L-1系標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度測(cè)量，精密度RSD為1.65%.使用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)6次，準(zhǔn)確度RSD為4.58%.符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求(-20%～10%)，結(jié)果見表2.

表2 精密度試驗(yàn)和準(zhǔn)確度結(jié)果

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

常溫下黨參樣品在0～100 min的穩(wěn)定性RSD為6.52%，結(jié)果見表3.

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.2 不同品種黨參的硒含量比較

采用同一地區(qū)的11個(gè)不同品種黨參探究對(duì)硒含量的影響，結(jié)果顯示不同品種之間的硒含量稍有不同但都在0.1 mg·kg-1以下(見圖2).

黨參品種圖2 不同品種黨參硒含量

4 結(jié) 論

建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度、精密度好，線性范圍廣，所用試劑毒性較小，靈敏度高，重復(fù)性高，實(shí)用性強(qiáng)的原子熒光光譜法，方法檢出限低為0.065 ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好.硒含量在0～40 μg·L-1質(zhì)量范圍內(nèi)與其熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R=0.999 9)；檢出限為Q=0.065 ng·mL-1；加樣回收率為113.33%，RSD為4.97%；精密度RSD為1.65%；準(zhǔn)確度RSD為4.58%；穩(wěn)定性RSD為6.52%；11個(gè)不同品種黨參之間的硒含量稍有不同但都在0.1 mg·kg-1以下.適用于測(cè)定黨參中的硒含量，為富硒黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供方法基礎(chǔ).