冉麗梅，周鴻立，劉宇琦，劉 瑩

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

茶是世界上僅次于水的第二大飲品，產(chǎn)于中國(guó)，是世界上的三大飲料之一[1].研究表明，茶具有多種功效，如防治心血管疾病[2]、抗炎[3]、抗癌[4]，其中抗氧化是衡量茶功能性活動(dòng)的一個(gè)重要指標(biāo)[5].近年來(lái)，以往被當(dāng)作廢料處理的沙棘葉受到學(xué)者們的日益重視.沙棘葉富含多種維生素和生物活性成分，如酚類(lèi)、黃酮類(lèi)和多糖，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用特性[6-7].研究發(fā)現(xiàn)，利用沙棘葉制得的保健茶含多種功能性成分，而且感官品質(zhì)良好、耐沖泡，長(zhǎng)期飲用具有降血壓、降血脂、防治便秘、抗腫瘤、抗癌等特殊功效[8-9].本研究以沙棘葉及其制品沙棘紅茶為研究對(duì)象，測(cè)定茶多酚、黃酮、多糖和咖啡堿的含量，分析活性成分之間的差異，采用DPPH·、ABTS+、OH·和還原力4種體外抗氧化活性測(cè)定方法，綜合比較沙棘葉及其制品紅茶的抗氧化活性，為沙棘茶保健飲品提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樣：采自吉林省蛟河市的沙棘葉，沙棘葉紅茶來(lái)自吉林市東北亞長(zhǎng)白山藥用植物開(kāi)發(fā)中心；DPPH·(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)：梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；過(guò)硫酸鉀：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰二氮菲：天津市化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀：天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；沒(méi)食子酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硝酸鋁：天津市化學(xué)大茂試劑廠；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)股份有限公司；分析天平：上海菁海儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 沙棘葉原料及其紅茶樣液的制備

1.3.2 活性成分的含量測(cè)定

茶多酚含量的測(cè)定方法：采用Folin-Ciocalteu法[10]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0874x+0.0492(R2=0.999 1)，根據(jù)水提液的吸光度值計(jì)算原料及沙棘紅茶中茶多酚的含量.

黃酮含量測(cè)定方法：采用NaNO2-Al(NO3)3[11]方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=9.27x-0.001(R2=9 998)，根據(jù)水提液的吸光度值計(jì)算原料及沙棘紅茶中黃酮的含量.

多糖含量的測(cè)定方法：采用苯酚-硫酸法[12]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7.09x-0.0602，(R2=0.999 6)，根據(jù)水提液的吸光度值計(jì)算原料及沙棘紅茶中多糖的含量.

咖啡堿含量的測(cè)定方法：采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法《茶咖啡堿測(cè)定》[13]，以咖啡堿為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.9972x-0.0329(R2=9 992)，根據(jù)水提液的吸光度值計(jì)算原料及沙棘紅茶中咖啡堿的含量.

1.3.3 體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH·清除能力：參照[14]的方法，分別取原料及沙棘紅茶水提液2 mL，配置成濃度梯度的試液，加入2 mL 0.1 mol/L的DPPH·，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度為A1；空白對(duì)照組為取2 mL樣品溶液加入2 mL無(wú)水乙醇，吸光度為A2；模型對(duì)照組為2 mL DPPH·加2 mL無(wú)水乙醇，吸光度為A0；再以2 mL無(wú)水乙醇和2 mL蒸餾水作為空白調(diào)零組.按照測(cè)得的吸光度代入公式計(jì)算清除率：

(1)

ABTS+清除能力：參照[15]的方法，分別取原料及沙棘紅茶水提液2 mL與2 mL ABTS+工作液混合，充分震蕩10 s，避光靜置6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)得A1；取2 mL蒸餾水與2 mL ABTS相同波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A2.按照測(cè)得的吸光度值代入公式計(jì)算清除率：

(2)

·OH清除能力：參照[16]的方法，取1 mL 0.75 mol/L的鄰二氮菲于試管中，依次加入2 mL PBS溶液，1 mL蒸餾水，1 mL 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的H2O2，37 ℃水浴30 min后，536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ap.其他條件不變，將H2O2換為蒸餾水，測(cè)定其吸光度為Ab；分別取原料及沙棘紅茶水提液代替蒸餾水，測(cè)得樣品吸光度為As.按照測(cè)得的吸光度值代入公式計(jì)算清除率：

(3)

總還原力實(shí)驗(yàn)：參照[17]的方法，分別取原料及沙棘紅茶水提液1 mL，加入2.5 mL的PBS溶液，加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，在50 ℃下水浴20 min，繼續(xù)加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min.取上層清液2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液和2.5 mL蒸餾水，混合均勻于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值.

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin 2019軟件進(jìn)行圖片處理，SPSS21.0進(jìn)行方差分析.所有數(shù)據(jù)均是3次測(cè)試的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘原料及其紅茶制品的活性物質(zhì)含量分析

對(duì)沙棘原料及其紅茶的茶多酚、黃酮、多糖和咖啡堿含量進(jìn)行測(cè)定，含量差異見(jiàn)表1.

表1 沙棘葉及紅茶中茶多酚、黃酮、多糖和咖啡堿的含量

表1顯示，茶多酚、黃酮和咖啡堿含量均是沙棘紅茶高于沙棘葉原料，其中多糖含量是沙棘葉原料高于沙棘紅茶，比沙棘紅茶高于近2.5倍，以上變化說(shuō)明4種化學(xué)成分的差異與加工技術(shù)有一定的關(guān)系.

2.2 沙棘葉原料及其紅茶制品的抗氧化能力

2.2.1 DPPH·自由基清除能力

圖1是沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)DPPH·自由基的清除率.DPPH·自由基清除原理主要利用抗氧化劑提供一個(gè)電子與DPPH·自由基的孤對(duì)電子配對(duì)，使自身的顏色變淺，吸光度變小.由圖可知沙棘紅茶對(duì)DPPH·具有較好的清除作用.比較相同濃度下兩種沙棘樣品的自由基清除率，發(fā)現(xiàn)紅茶的DPPH·自由基清除率顯著高于沙棘葉原料.其中沙棘葉原料的IC50=2.47 mg·mL-1，紅茶為IC50=0.76 mg·mL-1.該結(jié)果表明，沙棘紅茶抗氧化能力強(qiáng)于沙棘葉原料.

提取物濃度/(mg·mL-1)圖1 沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)DPPH·的清除能力

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

圖2是沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)ABTS+自由基的清除率.ABTS+是一種常用的檢測(cè)抗氧化活性的方法.ABTS+基團(tuán)在氧化劑的作用下能夠形成藍(lán)綠色的自由基，相反，隨著氧化劑濃度的降低，ABTS+自由基溶液會(huì)褪色，抗氧化劑吸收值會(huì)降低，是一種簡(jiǎn)單快速的測(cè)定方法.由圖可知沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)ABTS+自由基的清除效果隨其濃度的增大而增大.沙棘葉原料和紅茶的IC50分別是0.004 0和0.0038 mg·mL-1，在同樣試驗(yàn)濃度條件下，兩種沙棘樣品清除ABTS+自由基的能力相當(dāng).

提取物濃度/(mg·mL-1)圖2 沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)ABTS+清除能力

2.2.3 ·OH自由基清除能力

圖3是沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)·OH自由基的清除率.·OH通過(guò)對(duì)自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，試液提供氫原子，氫與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的自由基進(jìn)而終止反應(yīng)的進(jìn)行.由圖3可以看出，清除率與濃度呈線性關(guān)系.在相同試驗(yàn)濃度條件下，沙棘葉原料IC50=0.48 mg·mL-1，沙棘紅茶的IC50=0.41 mg·mL-1，所以沙棘葉紅茶的清除能力明顯高于沙棘葉原料.

提取物濃度/(mg·mL-1)圖3 沙棘葉原料及其紅茶制品對(duì)·OH清除能力

2.2.4 總還原力

圖4是沙棘葉原料及其紅茶制品還原力.通過(guò)自身的還原作用使自由基轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的分子,從而失去活性.吸光度越大,抗氧化能力就越強(qiáng),因此可以通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性的強(qiáng)弱.由圖4可知，沙棘葉原料和沙棘紅茶的還原力隨濃度的增加而增加，在較低的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系.同濃度的還原力由高到低依次是沙棘葉原料、沙棘紅茶.

提取物濃度/(mg·mL-1)圖4 沙棘葉原料及其紅茶制品的還原力

如圖5所示，是對(duì)沙棘葉原料及其紅茶制品的4個(gè)抗氧化體系的IC50的分析結(jié)果.從圖中可以看出紅茶的IC50值最小，說(shuō)明其抗氧化能力強(qiáng)于沙棘葉.

本試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘葉及其紅茶制品具有很強(qiáng)的體外抗氧化活性，且對(duì)不同的抗氧化能力測(cè)試方法中的自由基或離子反應(yīng)不同，因此在對(duì)某一活性物質(zhì)進(jìn)行抗氧化能力評(píng)價(jià)時(shí)，要綜合多種抗氧化方法.兩種沙棘葉樣品的茶多酚、黃酮、多糖和咖啡堿的含量具有明顯不同.從表1和圖5中可以看出，沙棘葉原料多糖含量明顯多于紅茶，但紅茶的茶多酚、黃酮和咖啡堿的含量多于沙棘葉，并且茶多酚的差異最為顯著.從抗氧化活性看出，紅茶的活性強(qiáng)于沙棘葉，茶葉多酚是以?xún)翰杷貫橹黧w的30余種酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，其酸性酚羥基具有很強(qiáng)的提供質(zhì)子氫的能力，可捕獲自由基使連鎖反應(yīng)中斷.本文與文獻(xiàn)報(bào)道的一致：茶多酚是茶葉的重要活性成分指標(biāo)，是抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[18-19].

圖5 沙棘葉原料及其紅茶制品抗氧化活性IC50雷達(dá)圖分析

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)4種抗氧化方法對(duì)兩種沙棘葉樣品進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅茶具有顯著的抗氧化活性，通過(guò)兩種沙棘葉樣品的活性成分研究結(jié)果表明，紅茶的多酚含量最豐富，說(shuō)明沙棘葉茶是一種富含茶多酚的保健茶.但尚未涉及化學(xué)成分變化與其抗氧化活性作用機(jī)制的相關(guān)性，需進(jìn)一步探究為更好地研究開(kāi)發(fā)沙棘葉茶產(chǎn)品提供科學(xué)的指導(dǎo).