王雨婷，周榮翔，李霽虹，張 瑤，周婷婷，陳文才，彭 云，湯曼利，馬桂珍，許建和

（1. 江蘇海洋大學環(huán)境與化學工程學院，江蘇 連云港 222000； 2. 江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222000； 3. 永清縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局種植業(yè)技術(shù)推廣站，河北 廊坊 065000；4. 江蘇海洋大學海洋科學與水產(chǎn)學院，江蘇 連云港 222000）

弧菌病是常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害[1]。近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的增加和養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，尤其是高密度養(yǎng)殖使水體自身調(diào)節(jié)能力降低，弧菌病害和氨氮 (NH4+-N) 過量對水產(chǎn)養(yǎng)殖的負面影響越來越嚴重，有關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中弧菌病防治和水體污染治理的研究備受關(guān)注[2]。目前主要采用化學、物理手段進行弧菌病的防治，但物理手段會造成水體二次污染，化學手段會導致病原菌的抗藥性，打破水域生態(tài)平衡，而生物手段則彌補了化學手段的不足，這類生態(tài)友好型的治理手段已成研發(fā)熱點[3]，生產(chǎn)上亟需更多的微生物制劑用于水產(chǎn)病害和水污染治理[4]。

光合細菌 (Photosynthetic bacteria, PSB) 是在厭氧條件下以光為能源，以二氧化碳 (CO2) 或有機物為碳源，進行不生氧光合作用的原核生物[5]。目前所知的光合細菌可分為著色桿菌科、外硫紅螺菌科、紫色非硫細菌、綠色硫細菌、多細胞絲狀綠細菌、螺旋桿菌科、含細菌葉綠素的專性好氧菌7大類群，其中在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面應用最多的為紫色非硫細菌[6-8]。光合細菌將水體中的有機物轉(zhuǎn)化為自身生長所需的能量，與病原微生物形成競爭關(guān)系，從而成為優(yōu)勢菌群，抑制病原菌的生長繁殖[9]，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生率，而且光合細菌所含的營養(yǎng)物質(zhì)能夠提高養(yǎng)殖魚蝦的免疫力，大幅提升其產(chǎn)量[10]。光合細菌作為生防菌株，已有研究主要針對其能夠高效降解水體中的三態(tài)氮、硫化氫等有害物質(zhì)[11]，而對同時具有弧菌拮抗作用和降解NH4+-N、亞硝態(tài)氮 (NO2?-N) 復合功能的光合細菌的研究較少。本研究通過分離篩選對弧菌具有抑制作用并能降解NH4+-N 和 NO2?-N 的優(yōu)良光合細菌，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的生物防治和養(yǎng)殖水污染治理提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 光合細菌富集培養(yǎng)基為氯化鈉 (NaCl) 2 g，七水硫酸鎂 (MgSO4·7H2O) 0.2 g，氯化銨 (NH4Cl) 1 g，磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1.75 g，乙酸鈉 (CH3COONa) 3 g，酵母粉 1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g 碳酸氫鈉(NaHCO3)。光合細菌分離培養(yǎng)基為光合細菌富集培養(yǎng)基添加1.7%瓊脂。光合細菌發(fā)酵培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。弧菌的培養(yǎng)及抑菌作用測定培養(yǎng)基為2216E 培養(yǎng)基 (蛋白胨 5 g、酵母膏 1 g、磷酸高鐵0.01 g，瓊脂 20 g，陳海水 1 000 mL，pH 8.0)。NH4+-N 降解培養(yǎng)基為 NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.2358 g，KH2PO41.75 g，CH3COONa 3 g，酵母粉 1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g NaHCO3(NH4+-N 質(zhì)量濃度為 50 mg·L?1)。NO2?-N降解培養(yǎng)基為 NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNO20.246 4 g，KH2PO41.75 g，CH3COONa 3 g，酵母粉 1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g NaHCO3(NO2?-N 質(zhì)量濃度為 50 mg·L?1)。檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基為NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4Cl 1 g，KH2PO41.75 g，檸檬酸鈉 3 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0，滅菌后加入 2 g NaHCO3。

1.1.2 病原菌 副溶血弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、鰻弧菌 (V. anguillarum)、創(chuàng)傷弧菌 (V. vulnificus) 由本實驗室保藏提供。

1.2 樣品的采集與富集

從連云港海域海州灣、車牛山島、灌河入?？诘葏^(qū)域采集海水樣品20個，海泥樣品4個，從南通市如東、啟東地區(qū)海域采集海水樣品4個，海泥樣品2個。

取5 mL樣品于25 mL富集培養(yǎng)基中，置于50 mL螺口離心管中，再加5 mL無菌液狀石蠟，30 ℃，2 000 lx 光照條件下富集培養(yǎng)，至培養(yǎng)物出現(xiàn)不同顏色。取1 mL培養(yǎng)物接種于新的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復3～4次，得到深色培養(yǎng)液。

1.3 海洋光合細菌的分離純化

采用雙層平板涂布法和雙層平板劃線法。取不同的樣品富集液，進行梯度稀釋，分別取不同樣品 10?4、10?5、10?6稀釋濃度的稀釋液 0.2 mL 涂布于光合細菌分離培養(yǎng)基平板上，用一層融化后冷卻至約45 ℃的分離培養(yǎng)基覆蓋，靜置凝固后，30 ℃光照條件下培養(yǎng)4 d。挑取紅色、紫色、棕色和綠色等不同顏色菌落至新的分離培養(yǎng)基的平板上進行三區(qū)劃線，進一步純化，至在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)一致。

1.4 海洋光合細菌對弧菌的抑制作用測定

1.4.1 光合細菌菌懸液的制備 將分離得到的光合細菌菌株接種于裝有25 mL LB液體培養(yǎng)基的50 mL離心管內(nèi)，加入5 mL滅菌石蠟，在30 ℃、光照強度 2 000 lx 下培養(yǎng) 4 d，菌液用無菌液體培養(yǎng)基調(diào)整光密度 (OD660 nm) 相等且 OD660 nm≥1.5。

1.4.2 對弧菌的抑菌作用測定 采用牛津杯法。將在2216E培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24 h的供試3種弧菌用無菌生理鹽水洗下，制備成濃度為107個·mL?1的菌懸液，取0.1 mL菌懸液涂布在2216E培養(yǎng)基平板上。在距離培養(yǎng)皿邊緣1.5 cm處的含菌平板四周均勻放置牛津杯，每個牛津杯中注入200 μL光合細菌不同菌株濃度為107個·mL?1的菌懸液，以等量的無菌培養(yǎng)基為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察測定抑菌圈直徑。每個菌株3個重復。

1.5 不同光合細菌菌株降解NH4+ -N和NO2? -N作用測定

1.5.1 標準工作曲線制作 分別采用靛酚藍分光光度法和鹽酸萘乙二胺分光光度法 (GB/T 11889—1989) 測定溶液中 NH4+-N 和 NO2?-N 質(zhì)量濃度。分別以 NH4+-N 質(zhì)量濃度和 NO2?-N 質(zhì)量濃度為橫坐標，OD637 nm和 OD538 nm為縱坐標，制作標準曲線，建立回歸方程。

1.5.2 降解率測定 將光合細菌菌懸液 (OD660 nm≥1.5) 按10%的接種量接入裝有25 mL液體降解培養(yǎng)基的50 mL離心管中，加入5 mL滅菌石蠟，每個菌株3個平行，在30 ℃、光照強度2 000 lx下靜置培養(yǎng) 4 d。發(fā)酵液于 4 ℃、5 000 r·min?1條件下離心20 min，取上清液，測定不同菌株上清液的吸光值，根據(jù)標準曲線計算不同菌株發(fā)酵液中的氮質(zhì)量濃度，以未接種的培養(yǎng)基作為對照，計算不同菌株的降解率。

式中：R為降解率；Ct為對照濃度；C0為處理濃度。

1.6 抑菌并高效降解NH4+ -N和NO2? -N光合細菌菌株的初步鑒定

1.6.1 形態(tài)學觀察 將篩選出的抑菌并高效降解NH4+-N 和 NO2?-N 的光合細菌菌株接種于光合細菌分離培養(yǎng)基上，在30 ℃、光照強度2 000 lx下靜置培養(yǎng)4 d，通過解剖鏡觀察培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及顏色，挑取單菌落，進行革蘭氏染色和鞭毛染色，顯微鏡觀察菌體大小、形態(tài)和染色結(jié)果。

1.6.2 生理生化試驗 挑取菌株 3個單菌落至含2 mL無菌水的離心管中，振蕩均勻并制成0.5麥氏濁度的均一菌懸液，吸取50～100 μL菌懸液接種至不同的生化管中，按照說明書于不同條件下培養(yǎng)，觀察反應管的顯色結(jié)果，將顯色結(jié)果與《結(jié)果詮釋表》比對，確定反應結(jié)果，以大腸桿菌為對照菌。

檸檬酸鹽利用試驗：將光合細菌菌懸液(OD660 nm≥1.5) 按 10% 的接種量接入裝有 25 mL檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基的50 mL離心管中，加入5 mL滅菌石蠟，在 30 ℃、2 000 lx 下靜置培養(yǎng) 4 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化，確認菌株是否生長。

根據(jù)形態(tài)觀察和生理生化反應結(jié)果，對照《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行初步鑒定。

1.6.3 16S rDNA 序列分析 將 P-3菌株樣品送至上海生工生物工程有限公司，測定菌株的16S rDNA序列。所得的基因序列拼接完整后與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST比對，選取近源序列，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 海洋光合細菌的富集

在光照厭氧條件下30個不同樣品多次富集培養(yǎng)，有6個樣品出現(xiàn)了顏色變化，分離自灌河入海口海泥 (A) 為棕色，車牛山島海水 (B) 和南通如東海泥 (C) 均為深紅色，南通啟東海水 (D) 和連云港高公島表層海水 (E) 為紅色，海州灣海水 (F) 為綠色 (圖1)，其他樣品渾濁，未變色。

圖1 富集篩選培養(yǎng)后的培養(yǎng)液A. 灌河入?？诤Ｄ?；B. 車牛山島海水；C. 南通如東海泥；D. 南通啟東海水；E. 連云港高公島表層海水；F. 海州灣海水。Figure 1 Culture medium after enrichment and screeningA. Sea mud of the river empties into the sea; B. Cheniushan Island sea water; C. Sea mud of Rudong, Nantong; D. Sea water of Qidong,Nantong; E. Surface water of Gaogong Island, Lianyungang;F. Sea water of Haizhou Bay.

2.2 海洋光合細菌的分離純化

將富集的30個樣品涂布于光合細菌平板上，從連云港高公島海域海水分離純化得到了橙紅色的P-1菌株，從南通如東海泥中分離得到紅色的P-2菌株，從連云港車牛山島海域海水分離得到深紅色P-3菌株。3個菌株的形態(tài)特征見表1、圖2和圖3，符合光合細菌的特征。

圖2 菌株P(guān)-1形態(tài)特征觀察a. 菌落特征；b. 菌株形態(tài)。Figure 2 Morphological characteristics of P-1 straina. Colony characteristics; b. Strain morphology.

圖3 菌株P(guān)-2形態(tài)特征觀察a. 菌落特征 (15×)；b. 菌株形態(tài)。Figure 3 Morphological characteristics of P-2 straina. Colony characteristics (15×); b. Strain morphology.

表1 分離得到的3個光合細菌菌株的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of three isolates of photosynthetic bacteria

2.3 光合細菌菌株對3種弧菌的抑制作用

菌株P(guān)-3對3種弧菌均有抑制作用，對鰻弧菌的抑菌圈較明顯，抑菌圈平均直徑為 (5.26±0.03)mm。菌株P(guān)-1、P-2在平板對峙試驗中，牛津杯周圍基本上未現(xiàn)抑菌圈，說明這2株菌對副溶血弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌沒有拮抗作用 (表2、圖4)。

圖4 不同光合細菌菌液對副溶血弧菌 (a)、鰻弧菌 (b) 和創(chuàng)傷弧菌 (c) 的抑菌效果Figure 4 Antibacterial effect of against V. parahemolyticus (a), V. anguillarum (b) and V. vulnificus (c)

表2 不同光合細菌菌株對弧菌的抗菌效果Table 2 Antibacterial effect of strains against Vibrios

2.4 具有抑菌作用的光合細菌菌株降解NH4+ -N和NO2? -N 作用的測定

將光合細菌菌液加入含 50 mg·L?1NH4+-N、NO?2-N降解培養(yǎng)基中，光照厭氧條件30 ℃培養(yǎng)4 d，測定發(fā)酵液的吸光值，并通過回歸方程計算氮濃度，結(jié)果見表3。3株菌株降解氮的能力較強，其中菌株P(guān)-2的NH4+-N降解率最高 (93.39%)，菌株P(guān)-3的 NO2?-N 降解率最高 (94.98%)。

表3 3株海洋光合細菌對氨氮和亞硝態(tài)氮的降解率Table 3 Ammonia nitrogen and nitrite nitrogen degradation rate of three marine photosynthetic bacteria

2.5 抑菌并高效降解NH4+ -N和NO2? -N光合細菌菌株的鑒定

根據(jù)不同菌株抑菌作用、NH4+-N 和 NO?2-N 降解作用結(jié)果，菌株P(guān)-3對3種弧菌的抑制作用以及對 NO2?-N 的降解作用最強，同時對 NH4+-N 的降解率較高，作為高效抑菌降解 NH4+-N 和 NO2?-N 的優(yōu)良菌株進行初步鑒定。

2.5.1 形態(tài)學觀察 菌落形態(tài)為紅色圓球狀，邊緣整齊，表面低突 (圖5)；該菌為革蘭氏陰性菌，細胞短桿狀，大小為 (1.34～1.62) × (0.33～0.59) μm，單根極生鞭毛 (圖6-a)；菌株P(guān)-3在光照厭氧條件下，培養(yǎng)液呈深紅色 (圖6-b)。

圖5 菌株P(guān)-3形態(tài)特征a. 菌落特征 (25×)；b. 菌株形態(tài)。Figure 5 Morphological characteristics of P-3 straina. Colony characteristics (25×); b. Strain morphology.

圖6 菌株P(guān)-3鞭毛染色 (a) 和液體培養(yǎng)物 (b)Figure 6 Flagella stained (a) and liquid culture (b) of P-3 strain

2.5.2 生理生化特性 菌株 P-3在麥芽糖、阿拉伯糖生化鑒定管顏色變?yōu)辄S色、陽性，葡萄糖管顏色無變化，說明該菌具有分解阿拉伯糖和麥芽糖的能力，不能利用葡萄糖作為碳源；尿素酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶實驗呈陽性，表明菌株P(guān)-3能分解氨基酸使其脫羧生成胺；苯丙氨酸、肌醇試驗為陰性；檸檬酸鈉作為唯一碳源培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)液顏色變?yōu)榧t色，為陽性，表明菌株P(guān)-3可以利用檸檬酸鹽 (表 4)。

表4 菌株P(guān)-3生理生化試驗結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical characteristics of P-3 strain

根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果和生理生化試驗，參照《伯杰細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株P(guān)-3進行初步鑒定。

在厭氧光照條件下培養(yǎng)物為深紅色的光合細菌有紅假單胞菌屬、紅螺菌屬和紅微菌屬，紅螺菌屬菌體為螺旋狀，不具有脫氮能力，生境為淡水環(huán)境；紅微菌屬菌體為卵圓形至檸檬狀，依靠周生鞭毛運動，且不能利用檸檬酸鹽為碳源；紅假單胞菌屬的菌體為球形或桿狀，單根極生鞭毛運動，不能利用葡萄糖，可以利用檸檬酸鹽且具有脫氮作用，生境為海水環(huán)境，菌株P(guān)-3細胞形態(tài)、生理生化特性等與紅螺菌屬和紅微菌屬不同，而與紅假單胞菌屬的形態(tài)和生理生化特性一致，初步認為菌株P(guān)-3為紅假單胞菌 (Rhodopseudomonassp.，表 5)。

2.5.3 菌株 P-3 16S rDNA 序列分析 將菌株 P-3的16S rDNA基因序列與NCBI中的序列進行比對，選取同屬內(nèi)同源相似性較高的不同菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株P(guān)-3的16S rDNA與多株沼澤紅假單胞菌(R. palustris) 的相似性為99.31%，結(jié)果見圖7。

圖7 基于P-3菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 7 Phylogenetie tree of P-3 strain based on 16S rDNA gene sequences

3 討論

有學者認為光合細菌具有類胡蘿卜素[12-13]、細菌葉綠素[14]等光合色素，在光照培養(yǎng)條件下，其培養(yǎng)液大多呈紅色、紫色或者綠色等[5]，如張小倩等[15]從遼河入海口篩選出1株產(chǎn)紅色色素能力較強的紅假單胞菌屬菌株，王蕊等[16]從凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) 池塘水樣、底泥中分離到1株類胡蘿卜素含量較高的糞紅假單胞菌 (R.faecalis)。本研究分離到的3株光合細菌厭氧培養(yǎng)液顏色均為紅色，與已有的研究中菌液顏色相符，利用這一特性初步篩選菌株，有助于尋找到更多的光合菌株資源。

弧菌屬是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見的細菌性病原[17-18]，目前用于弧菌病的拮抗菌主要有乳酸菌[19]、芽孢桿菌[20]、光合細菌[21]等。張信娣等[22]研究發(fā)現(xiàn)球形紅假單胞菌X3在平板擴散法中對水產(chǎn)致病菌有微弱的抑制作用。本研究中的沼澤紅假單胞菌對副溶血弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌均具有拮抗作用，與張信娣等[22]的研究結(jié)果相似。

光合細菌可以吸收水體中的NH4+-N、硝態(tài)氮(NO3?-N) 和 NO2?-N，起到改善水質(zhì)、修復水環(huán)境的作用[23-25]。目前對改善養(yǎng)殖環(huán)境的光合細菌種類研究頗多，如海洋著色菌 (Marichromatium gracile)[26]、紅假單胞菌[27]、類球紅細菌 (Rhodobacter sphaeroides)[28]、沙氏外硫紅螺菌 (Ectothiorhodospira shaposhnikovii)[29]等，這些光合菌降解效率各不相同。本試驗分離篩選得到的菌株P(guān)-3與金春英等[30]和劉珍珠等[31]研究的沼澤紅假單胞菌降解效果相近。金春英等[30]分離出1株沼澤紅假單胞菌CQV97，其對不同質(zhì)量濃度的 NH4+-N 和 NO2?-N 最大去除率分別為35%～96%和46.850%～99.998%；劉珍珠等[31]從冰川前緣原生裸地土壤中分離出1株為沼澤紅假單胞菌LG，菌株對NH+4-N的轉(zhuǎn)化率最高為65.71%，對NO3?-N的轉(zhuǎn)化率為95.58%，已有的研究表明光合細菌在養(yǎng)殖水體的NH4+-N和亞硝酸鹽降解中發(fā)揮了重要作用。

本試驗分離篩選得到的菌株P(guān)-3在NH4+-N和NO?2-N質(zhì)量濃度為50 mg·L?1時，對NH+4-N和NO?2-N的降解率分別達89.68%和94.98%，同時對副溶血弧菌、鰻弧菌和創(chuàng)傷弧菌均具有抑制作用，具有復合功能，表現(xiàn)出潛在的開發(fā)應用前景。