王志強(qiáng) 張慧華

(1.南陽市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，河南南陽 473000；2.河南民興生物科技股份有限公司，河南社旗 473300 )

絲膠是包覆在絲素外層的蛋白質(zhì)，主要起保護(hù)絲素和膠黏的作用[1]。因絲膠具有良好的水溶性[2]，因此傳統(tǒng)絹紡行業(yè)中絲膠通常會被去除。蠶絲在高溫堿性條件下可以去除絕大部分的絲膠，而絲膠中主要成分為蛋白質(zhì)，也含有少量的碳水化合物、脂類及色素。絲綢絹紡廠去除絲膠的過程稱為精煉，精煉液中含有濃度極高的絲膠蛋白，而以往精煉液都會被排放至污水處理站加以處理，這一方面給污水處理帶來嚴(yán)峻的壓力，另一方面絲膠作為天然的自然資源未得到利用。近年來，從絲綢絹紡精煉液中提取絲膠蛋白的技術(shù)已取得顯著成果，如有酸析法、化學(xué)混凝法、有機(jī)溶劑沉淀法、膜過濾技術(shù)[3-4]等。絲膠蛋白是一種球狀蛋白質(zhì)，具有良好的吸濕性[7]，張雨清等報(bào)道的絲膠的抗氧化能力可與維生素C相媲美[8]，日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白可作為一種新型的非離子表面活性劑[9]，饒建偉等人將絲膠、絲素混合制備成絲混合物，再引入制孔劑制備絲蛋白骨架[13]，現(xiàn)階段對從絹紡精煉液中提取回收的絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道，本文旨在探究從絹紡精煉液中回收的絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)和起泡性，為絲膠蛋白進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

絹紡精煉液，取自河南民興生物科技股份有限公司的蠶桑條吐脫膠工藝池，絲膠蛋白質(zhì)量體積濃度0.87 mg/mL。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、碳酸鈉、檸檬酸三鈉、濃鹽酸、尿素、精氨酸，國藥試劑，均為分析純；BCA蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品；1-苯胺-8-萘磺酸，國藥試劑，為色譜純；溴化鉀、三氯乙酸、異硫氰酸苯酯、三乙胺，均為分析純，美國 Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器

0.5 m2陶瓷膜(孔徑200 nm)、36 m2有機(jī)膜(8 000 Da),購自江蘇久五高科技股份有限公司；LPG-5型高速離心噴霧干燥機(jī)，購自常州異能干燥設(shè)備有限公司；WT600-1F型蠕動泵，購自保定蘭格恒流泵有限公司；恒溫水浴鍋，購自浙江力辰儀器科技有限公司；PHS-3E型pH計(jì)，購自上海雷磁科技有限公司；超純水機(jī)，購自德國PURELAB公司；凱式定氮儀，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀、電動移液器、移液槍，購自美國Thermo公司；萬分之一電子天平，購自上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絲膠蛋白提取回收

將絹紡精煉液(絲膠蛋白質(zhì)量體積濃度0.87 mg/mL)首先經(jīng)過預(yù)處理出渣和采用截留分子量為400 000 Da(蛋白分子量的計(jì)量單位)的超濾膜精出渣，能完全去除絲膠廢液中殘?jiān)?，其次采用截留分子量?00 000 Da的超濾膜截留分子量400 000 Da以上的絲膠蛋白(液體)，而400 000 Da以下的絲膠蛋白則透過超濾膜，最后再用截留分子量為8 000 Da的納濾膜濃縮截留分子量為400 000 Da的滲透液，滲透液洗滌純化后再經(jīng)高速離心噴霧干燥得到分子量為8 000～400 000 Da的絲膠蛋白粉(固體)。絲膠蛋白粉中蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法，具體操作參照GB 5009.5-2016。

1.2.2 圓二色譜分析

在蛋白質(zhì)的規(guī)則二級結(jié)構(gòu)中，肽鍵是高度有規(guī)律排列的，根據(jù)不同蛋白質(zhì)或者多肽產(chǎn)生的CD譜帶的位置的變化和產(chǎn)生峰的強(qiáng)弱程度，可以獲取蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。首先將絲膠蛋白用磷酸鹽緩沖液配制為質(zhì)量體積濃度為0.20 mg/mL的蛋白溶液。因絲膠蛋白為球狀蛋白質(zhì)，因此用圓二色譜儀分別檢測其在180～220 nm和在200～240 nm處的紫外峰。具體操作如下：取300 μL 0.20 mg/mL的絲膠蛋白樣品溶液，選擇光徑為 0.2 cm的石英杯，調(diào)整儀器掃描速率至170 nm/min和1.0 s響應(yīng)時(shí)間，上機(jī)掃描2～3次，得到絲膠蛋白CD圖譜。既可以分析出絲膠蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的具體含量。

1.2.3 傅立葉紅外光譜分析

紅外光譜是測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量的重要手段之一。蛋白質(zhì)在紅外光譜中有很多特征吸收峰，其中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700/cm)，包括了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息(無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角等)，因此酰胺Ⅰ帶常用來解析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。首先對樣品進(jìn)行壓片處理，具體操作如下：將200 mg KBr和2 mg絲膠蛋白分別置于鼓風(fēng)干燥箱中，100 ℃干燥1.5 h，取出混合均勻后，再置于研缽中將二者充分研磨至大小為1～2 μm的顆粒，必要時(shí)可要用100目濾網(wǎng)進(jìn)行過濾以保證顆粒大小均一，最后在進(jìn)行壓片處理。通過傅里葉紅外光譜儀在4 000～400/cm處進(jìn)行全波段掃描，分辨率4/cm，掃描33次。用200 mg干燥后的KBr進(jìn)行同樣操作,做KBr陽性對照。

1.2.4 絲膠蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性

探究在pH和溫度恒定條件下絲膠蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性。具體操作如下：配置不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%)的絲膠蛋白溶液，調(diào)節(jié)絲膠蛋白溶液pH至7.0，取上述不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)絲膠蛋白溶液40.0 mL于100 mL燒杯中，并置于恒溫套筒中，調(diào)節(jié)恒溫套筒溫度至25 ℃，用高速分散機(jī)經(jīng)行剪切，剪切速度10 000 r/min，保持3 min，記錄剪切后的泡沫液面高度，靜置30 min后再次記錄泡沫液面高度，具體計(jì)算過程參考文獻(xiàn)[16]。試驗(yàn)以大豆分離蛋白為陽性對照探討絲膠蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲膠蛋白的蛋白質(zhì)含量

按照GB 5009.5-2016中蛋白質(zhì)含量第一種檢測方法，得到絲膠蛋白粉中蛋白質(zhì)含量為92.4%。

2.2 圓二色譜分析絲膠蛋白二級結(jié)構(gòu)

參照絲膠蛋白的圓二色譜圖并利用CDNN軟件預(yù)測絲膠蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所占的摩爾百分比。分析結(jié)果得出：絲膠蛋白在180～260 nm范圍的紫外區(qū)內(nèi)有一較弱的吸收峰，說明絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含有少量的α-螺旋，傅立葉紅外光譜分析絲膠蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)所占的摩爾百分比僅為3.9 %。另外，由于絲膠蛋白是一種球狀蛋白質(zhì)，而球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有β-轉(zhuǎn)角和β-折疊是其典型特征表現(xiàn)，這種構(gòu)象使得絲膠蛋白分子中的多肽鏈反相折疊，同時(shí)這兩種結(jié)構(gòu)的存在促使了絲膠蛋白球狀結(jié)構(gòu)的形成。

2.3 傅立葉紅外光譜分析絲膠蛋白

依據(jù)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)紅外光譜特征譜帶中1 650～1 660 /cm處譜峰是由酰胺Ⅰ C-O伸縮振動形成的，1 530 /cm處譜峰為酰胺Ⅱ C-N伸縮振動和N-H面內(nèi)變形振動形成的[9-10]。分析結(jié)果可以看出：絲膠蛋白在1 633 /cm和1 239 /cm處有明顯的吸收峰，表明絲膠蛋白中含有β-折疊結(jié)構(gòu)；在1 693 /cm和1 270 /cm處有正吸收峰出現(xiàn)，表明絲膠蛋白中含有β-轉(zhuǎn)角；在1 663 /cm和1 303 /cm處有較弱的吸收峰出現(xiàn)，表明絲膠蛋白中含有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)；在1 637～1 648 /cm之間有強(qiáng)烈的吸收峰出現(xiàn)，說明絲膠蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有大量的無規(guī)卷曲。具體含量見表1。

表1 絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)占比

2.4 不同濃度絲膠蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性

對于在pH和溫度恒定條件下絲膠蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性，分析計(jì)算的結(jié)果，當(dāng)絲膠蛋白在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，其乳化性只有15.49 m2/g，乳化穩(wěn)定性為12.22 m2/g；當(dāng)絲膠蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至3.0 %時(shí)，絲膠蛋白的乳化性為為22.00 m2/g ，乳化穩(wěn)定性為15.80 m2/g；當(dāng)絲膠蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%時(shí)，期乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為21.89 m2/g和16.20 m2/g。說明在pH和溫度恒定的條件下隨著絲膠蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，其乳化性和乳化穩(wěn)定性也隨之增強(qiáng)。以大豆分離蛋白(SPI)為陽性對照，在相同的蛋白質(zhì)濃度情況下，絲膠蛋白的乳化性明顯優(yōu)于SPI。大豆分離蛋白以作為良好的食品添加劑而得到廣泛認(rèn)可，如其加入到面包、奶制品等食品中，可使產(chǎn)品狀態(tài)保持蓬松且穩(wěn)定的產(chǎn)品相態(tài)。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH和溫度恒定條件下，絲膠蛋白的乳化性均優(yōu)于SPI，絲膠蛋白具有作為新型乳化劑的潛質(zhì)。

3 小結(jié)與討論

本文通過膜過濾技術(shù)從絹紡精煉液提取回收絲膠蛋白，該技術(shù)方法絲膠回收率高，提取過程中零添加，且得到的絲膠蛋白分子量范圍較小，有利于絲膠產(chǎn)品的開發(fā)。利用圓二色譜儀和紅外光譜儀對絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，約占總量的45.6%，并含有部分β構(gòu)象(β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，約占29.5%、23.7%)，含少量的α螺旋結(jié)構(gòu)，約占總量的3.9%。絲膠蛋白的乳化性優(yōu)于SPI，為絲膠蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論參考。因此，絹紡精煉液中絲膠蛋白的提取、研究、開發(fā)應(yīng)用不僅可以達(dá)到節(jié)能減排的環(huán)境保護(hù)目的，還可以變廢為寶，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。