朱水榮，張 政，姚蘋蘋，楊 勇，方 磊，張嚴(yán)峻

豬鏈球菌(Streptococcussuis，Ss)是一種人獸共患病原菌。該菌是1987年由Kilpper-Balz發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新種[1-2]，早期按照莢膜抗原的差異分為35個(gè)血清型(1～34型，1/2型)[3]，2005年，Hill等[4]從基因水平證實(shí)其中的32及34型為鼠口腔鏈球菌(StreptococcusofisraRi), 豬鏈球菌被分為33個(gè)血清型(1～31型，1/2型和33型)。近年來，基于16S rRNA以及其它保守性較高的看家基因的序列分析，血清型20、22、26、33又被排除豬鏈球菌家族[5]，這次豬鏈球菌被分為29個(gè)血清型(1～19型，21型，23～25型，27～31型和1/2型)。目前已知，能感染人的致病血清型主要包括1/2、1、2、7、9和14型6種類型[6-11]，其中以2型豬鏈球菌 (Streptococcussuistype 2，SS2)致病力最強(qiáng)。2型豬鏈球菌具有很強(qiáng)的侵襲能力，并產(chǎn)生致病性很強(qiáng)的外毒素，引起感染者發(fā)生嚴(yán)重的不可逆的休克及DIC，最后發(fā)生多器官功能衰竭而死亡[12]。1968年，丹麥?zhǔn)状螆?bào)道豬鏈球菌感染導(dǎo)致人腦膜炎的病例[13]。其后，在亞洲、美洲、歐洲、大洋洲等地區(qū)均有人感染豬鏈球菌病例報(bào)道，累計(jì)感染人數(shù)已超過1 600人[14]。豬鏈球菌的致病機(jī)理雖然現(xiàn)在還不是很清楚,但研究表明和其毒力因子有密切的相關(guān)性[15-18]。以往學(xué)者們主要針對Cps、mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh、gapdh等毒力相關(guān)基因進(jìn)行檢測[19-21]，最近報(bào)道[22]有ciaHR、dltA、endoB、lgA1、manN、neuB、Permease、pgdA、purD、rgg、salKR、dpeIV、serum、sortase、sspA、sum_61等多個(gè)毒力相關(guān)基因可被檢測到，本文參考文獻(xiàn)[22-24]中毒力基因相關(guān)引物序列，對歷年來收集的浙江省散發(fā)豬鏈球菌感染者分離株進(jìn)行了PCR檢測，以了解毒力基因群分布情況。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 28株實(shí)驗(yàn)用豬鏈球菌菌株均為2005-2020年浙江省各地疾病預(yù)防控制中心分離上送，分別來自臺州(6株)、嘉興(6株)、寧波(3株)、紹興(3株)、溫州(3株)、衢州(2株)、金華(2株)、杭州(1株)、湖州(1株)、麗水(1株)10個(gè)地區(qū)，病例無集中，非共同暴露，無二代病例及人-人之間的傳播，均為歷年來浙江省散發(fā)豬鏈球菌感染者分離株。實(shí)驗(yàn)對照株大腸埃希菌ATCC 8739標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)譜儀鑒定菌株對照用。

1.2 菌株鑒定 所有菌株均采用法國生物梅里埃VITEK 2 Compact高級專家系統(tǒng)及其質(zhì)譜儀BIOM系統(tǒng)及其質(zhì)譜儀pVITEK MS V2.3.3系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定檢測，用豬鏈球菌分型血清(SSI，丹麥)作血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)，以鑒定血清型。另參考文獻(xiàn)[24-26]對鏈球菌屬特異性tuf基因、豬鏈球菌種特異性16SrRNA基因與血清型2型Cps2J、7型Cps7H及9型Cps9D鑒別檢定基因分別進(jìn)行PCR檢測，以期相互佐證實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果，PCR引物見表1。

1.3 菌株DNA提取 挑取SS2單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種血平板，5% CO237 ℃培養(yǎng)18～24 h，無菌棉簽刮取適量，置于裝有1 mL滅菌生理鹽水的EP管中，上下?lián)u勻，熱裂解儀70 ℃10 min后，高速離心去上清，接下來使用QIAamp DNA Mini kit(50)DNA提取試劑盒，按說明書步驟提取豬鏈球菌DNA基因組，提好的DNA置于4 ℃冰箱以供PCR用。

1.4 主要試劑與儀器

1.4.1 PCR試劑與反應(yīng)條件 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM version 2.0 plus dye)RR901；PrimeSTARTMHS DNA Ploymerase[Prime STARTMHS DNA Ploymerase、5loymeraseRTMHS DNA P(Mg2+plus)、dNTP Mixture]；DNA Marker DL 2 000/100 bp DNA Ladder Marker均購自寶生物工程TaKaRa(大連)有限公司,反應(yīng)條件與方法參照試劑說明書。

1.4.2 儀器 法國生物梅里埃VITEK 2 Compact高級專家系統(tǒng)(Systems版本05.01)；法國生物梅里埃質(zhì)譜儀 BIOM物梅里埃質(zhì)譜儀act000/100 bp DNA；美國Thermo公司的二氧化碳培養(yǎng)箱；德國Eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR；英國TECHNE DRI-Block DB·2D裂解儀；德國Eppendorf AG22331 Hamburg離心機(jī)；美國MiniRun GEL Electrophoresis System BIOER凝膠電泳儀；美國FR-200A全自動紫外可見分析裝置。

1.5 引物與合成 參考文獻(xiàn)[22-26]合成鏈球菌屬tuf基因、豬鏈球菌種16SrRNA基因、血清型鑒定基因Cps2J(兼莢膜毒力基因)、Cps7H及Cps9D以及毒力基因mrp、epf、sly、orf2、fbps、gdh、gapdh、ciaHR、dltA、endoB、lgA1、manN、neuB、Permease、pgdA、purD、rgg、salKR、dpeIV、serum、sortase、sspA、sum_61等引物，所有引物及探針序列交由TAKARA公司/上海生工公司合成，測序交由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司。PCR擴(kuò)增條件、退火溫度及片段大小均參考相關(guān)文獻(xiàn)執(zhí)行，少數(shù)引物PCR反應(yīng)條件需要重新調(diào)整，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for PCR amplification

1.6 PCR產(chǎn)物檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)用DNA Marker DL 2 000/100 bp DNA Ladder Marker電泳以作對照。電泳產(chǎn)物用FR-200A型全自動紫外與可見分析裝置獲取圖像。

1.7 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 所有菌株均進(jìn)行16S rRNA全基因測序，測序結(jié)果應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接比對，對齊序列利用Mega 7.0軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 生化及血清學(xué) 取在羊血瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)20 h的菌落，涂片革蘭染色鏡檢，結(jié)果均為長鏈或短鏈革蘭陽性球菌。取適量純培養(yǎng)菌落用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定，均為豬鏈球菌，檢測可信值均在95%～99.9%。挑取單個(gè)菌落分別與豬鏈球菌分型血清逐個(gè)作血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)以滅菌生理鹽水作對照，所有菌株均與2型豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生凝集，經(jīng)鑒定所有菌株均為血清型2型。

2.2 質(zhì)譜儀鑒定 以無菌槍頭蘸取單個(gè)新鮮菌落均勻涂布于VITEK MS靶板的圓孔中央，再加上1 μL基質(zhì)溶液，晾干后上機(jī)檢測。全部菌株經(jīng)VITEK MS V2.3.3實(shí)施基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS) 技術(shù)鑒定檢測，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)大腸菌ATCC 8739作為質(zhì)控對照菌株，28株菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定均為豬鏈球菌。

2.3 屬、種及型PCR檢測 抽提所有菌株DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測，結(jié)果為鏈球菌屬特異性tuf基因、豬鏈球菌種特異性16SrRNA基因以及血清型2型Cps2J基因(兼莢膜多糖毒力基因)均出現(xiàn)相應(yīng)大小片段，而對照血清型7型Cps7H及對照血清型9型Cps9D兩基因均未有對應(yīng)條帶擴(kuò)增出。圖1為ZJ-6號菌株屬、種、型及11種毒力基因PCR檢測電泳結(jié)果，圖2為ZJ-6號菌株另外13種毒力基因PCR檢測電泳結(jié)果。

M:100 bp DNA Ladder Marker圖1 ZJ-6菌株屬、種、型及11種毒力基因PCR結(jié)果Fig.1 Genus, species, serotype and 11 virulence genes of the ZJ-6 strain, determined by PCR analysis

M:100 bp DNA Ladder Marker圖2 ZJ-6菌株13種毒力基因PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of 13 virulence genes of the ZJ-6 strain

2.4 毒力因子PCR檢測 28株菌株經(jīng)PCR檢測，其中Cps2J、mrp、orf2、fbps、gdh、gapdh、ciaHR、dltA、lgA1、manN、neuB、pgdA、purD、dpeIV、serum、sortase及sspA共17種毒力基因均被檢出預(yù)期目的大小陽性條帶，檢出率為100%；除1株ZJ-31未檢測出epf、sly、endoB、Permease、rgg及sum_61 6種毒力基因目標(biāo)條帶，其它菌株均檢測出相應(yīng)這些毒力基因目標(biāo)條帶，檢出率均為96.43%(27/28)；15株菌株(ZJ-8、ZJ-9、ZJ-10、ZJ-18、ZJ-19、ZJ-22、ZJ-23、ZJ-24、ZJ-25、ZJ-26、ZJ-29、ZJ-30、ZJ-31、ZJ-33及ZJ-34)未檢出salKR毒力基因目標(biāo)條帶，該毒力基因檢出率最低，僅為46.43%(13/28)。圖3為28株SS2菌株24種毒力基因檢測率豎狀圖結(jié)果。

圖3 28株菌株24種毒力基因的檢出率Fig.3 Detection rate of virulence genes among the 28 strains

2.5 遺傳進(jìn)化 應(yīng)用Mega 7.0軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹，樹狀圖結(jié)果顯示除了1株來自2018年的ZJ-31菌株單獨(dú)在另一分枝外，其它菌株同源性極高，進(jìn)化相同均在同一分枝，見圖4。

圖4 28株菌株16S rRNA基因測序樹狀圖Fig.4 Tree map of the 28 strains, determined by 16S rRNA gene sequencing

3 討 論

豬鏈球菌感染呈世界性分布。近年來，基于16SrRNA以及其它保守性較高的看家基因的序列分析，血清型20、22、26、32、33以及34血清型均被排出豬鏈球菌家族[5]，同時(shí)也有新的血清型被發(fā)現(xiàn)[27]，可見豬鏈球菌血清學(xué)分型的復(fù)雜性。豬鏈球菌血清型分布有著明顯的地域特征，在北美血清型2型及3型是較為常見的血清型，而在歐洲血清型9型卻是流行血清型[14,28]，亞洲的泰國、越南及中國臺灣、香港等大多流行株為血清型2型[29-34]。目前，在所有血清型中，2型豬鏈球菌仍是毒力最強(qiáng)、危害最大、流行最為廣泛的血清型。1998年江蘇和2005年四川人感染豬鏈球菌病疫情大暴發(fā)的病原也是血清2型菌株[35-37]。

研究將本實(shí)驗(yàn)室自2005-2020年收集的，來自浙江省10個(gè)地市散發(fā)病人的分離株進(jìn)行了復(fù)蘇。鑒于傳統(tǒng)的微生物檢測鑒定手段一般都難以用一種手段獲得準(zhǔn)確可靠的鑒定信息，本次在傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合近年來發(fā)展的蛋白質(zhì)譜技術(shù)以及核酸檢測技術(shù)對收藏復(fù)活菌株全部進(jìn)行了綜合鑒定，共鑒定出SS2菌株28株。需要說明的是，在菌株使用VITEK 2 Compact儀器鑒定時(shí)，菌株一定要新鮮菌落，18～20 h培養(yǎng)即可，制作懸液時(shí)盡量均一分散，濃度符合，否則鑒定可信值偏低甚至于鑒定為其它鏈球菌類；MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果快速，只要靶板孔內(nèi)涂菌均勻適量，其他要求不高，不失為實(shí)驗(yàn)室快檢好幫手。但上述兩種儀器檢測結(jié)果鑒定到種水平，個(gè)人認(rèn)為是可信的，如確定到具體血清型別，仍需結(jié)合血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)再次確認(rèn)。有條件的實(shí)驗(yàn)室，不妨再結(jié)合核酸快診技術(shù)，檢測特異性種及型別基因，相互佐證以作綜合判斷。 不同豬鏈球菌菌株之間毒力存在差異，如何確定豬鏈球菌的毒力水平一直以來都是一個(gè)難題。比較一致的一個(gè)觀點(diǎn)是細(xì)菌的致病力來自于不同毒力因子在致病過程中的協(xié)同作用。因此，相比其它分型方法,基于毒力基因譜的分型方法能夠更好的將其與細(xì)菌的毒力相關(guān)聯(lián)[38-39]。早期，大多數(shù)豬鏈球菌的毒力因子研究僅集中于mrp、epf和sly，并根據(jù)毒力因子的差異，將菌株分為強(qiáng)毒力株(mrp+epf+)、弱毒力株(mrp+epf-)、無毒力株(mrp-epf-)[40]。后來學(xué)者們又增進(jìn)Cps2J、orf2、fbps、gdh、gapdh毒力因子的檢測研究。2015年董文陽等[41]報(bào)道通過PCR檢測101株SS2中的22個(gè)毒力相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)所有菌株被分成兩個(gè)毒力基因群，其中B群epf、sly、SpyM3_0908、endoD、SMU_61-like和rgg檢出率很高，但在A群中檢出率低，鑒于單個(gè)毒力因子的存在與否很少決定毒力[39]，因此該研究推測毒力因子的特定組合可能至關(guān)重要，據(jù)此結(jié)合毒力實(shí)驗(yàn)測試，研究認(rèn)為B群應(yīng)為強(qiáng)毒力基因群，揭示了來自中國的強(qiáng)毒和低毒SS2分離株之間的遺傳差異。本研究參考上述報(bào)道，對28株SS2進(jìn)行了24種毒力基因的檢測，除salKR毒力基因檢出率僅為46.43%外，1株ZJ-31菌株(經(jīng)查為2018年分離)其毒力群基因檢測結(jié)果與另外27株SS2菌株有明顯不同，未檢測出epf、sly、endoB、Permease、rgg及sum_61這6種毒力基因，而其它27株則均有檢測出23種毒力基因，這可能與該菌株的遺傳進(jìn)化背景不同相關(guān)。鑒于此，本次對28株SS2菌株16SrRNA基因進(jìn)行了測序，Mga 7.0軟件構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹，分析顯示，28株菌株被分成2個(gè)進(jìn)化分枝，其中27株菌株同源性極高歸屬為同一進(jìn)化分枝，僅1株ZJ-31菌株另分為一枝進(jìn)化群，此與上述毒力群基因檢測結(jié)果似乎相符。結(jié)果提示，2005-2018年浙江省豬鏈球菌病散發(fā)流行株攜帶多個(gè)相同毒力群基因，各菌株間雖沒有相關(guān)的流行病學(xué)資料佐證，但通過對16SrRNA基因進(jìn)化分析，各菌株長期處在一個(gè)相對穩(wěn)定的進(jìn)化狀態(tài)，可能各菌株來源背景相同。直至2018年，出現(xiàn)個(gè)別分離株其攜帶毒力群基因有明顯不同，遺傳進(jìn)化顯示其來源或背景也有明顯不同，該變化是否有引起豬鏈球菌病致病性變化的發(fā)生以及流行病學(xué)改變，值得我們今后予以持續(xù)性關(guān)注。