田 旭，何 航，武秋申，程雅婷，萬 堃，周勤飛，劉安芳，向邦全，章 杰*

（1.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技學(xué)院，重慶 404155；3.重慶市萬州區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，重慶 404000）

動物飼糧中添加適量纖維性物質(zhì)可促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收來提高生產(chǎn)性能[1-2]，而家禽無纖維素分解酶，只能依靠腸道微生物分泌的酶來消化[3]。飼糧纖維類型可顯著影響動物腸道微生物菌群組成。如Chen 等[4]研究指出，斷奶仔豬飼喂10%麥麩纖維或10%豌豆纖維飼糧可顯著改變腸道菌群結(jié)構(gòu)；Zhao 等[5]研究表明，飼糧中添加 5%麥麩可顯著提高豬糞便中乳酸桿菌與纖維菌數(shù)量；Amerah 等[6]研究指出，不同纖維源可影響肉雞腸道微生物菌群特征，從而改變營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。鵝屬草食性家禽，具有耐粗飼的特點(diǎn)，可利用高纖維含量的草和秸稈等，其盲腸十分發(fā)達(dá)，具有類似瘤胃的發(fā)酵功能[7]，在營養(yǎng)消化吸收、黏膜代謝、免疫應(yīng)答等過程中具有重要作用[8-9]。苜蓿、黑麥草、燕麥草和花生秧具有營養(yǎng)價(jià)值高、適口性好、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。目前，有關(guān)這4 種纖維源在鵝生產(chǎn)應(yīng)用中的研究報(bào)道較少，且已有報(bào)道多關(guān)注于不同纖維源對鵝生長性能、胴體特征和腸道發(fā)育等方面的影響[10-11]，對腸道微生物的報(bào)道較少。育雛期0～4 周齡的鵝生長發(fā)育迅速，腸道菌群處于定植和構(gòu)建的關(guān)鍵時(shí)期[12]。因此，本研究旨在探討苜蓿、黑麥草、燕麥草和花生秧4 種纖維源對0～4 周齡四川白鵝腸道微生物菌群的影響，旨在揭示纖維類型與腸道微生物菌群的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和飼糧 選取120 只體重（86.02±6.35）g、體況相近的1 日齡四川白鵝飼喂于西南大學(xué)畜牧實(shí)訓(xùn)基地，隨機(jī)分為4 組，分別飼喂含苜蓿、黑麥、燕麥或花生秧飼糧（不同草粉纖維組成見表1），每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只鵝，試驗(yàn)期共28 d。采用半開放式鵝舍，地面平養(yǎng)，常規(guī)免疫，自由采食飲水，每日飼喂4 次（07:30、12:30、17:00、21:00）。試驗(yàn)期環(huán)境溫度為（26.20±2.52）℃，濕度（88.50±4.72）%。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表2。

表2 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 盲腸內(nèi)容物樣品采集 28 日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3 只鵝屠宰，迅速取出盲腸并結(jié)扎，經(jīng)75% 酒精擦拭消毒外表后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺，將同一重復(fù)盲腸樣品剪開后混合均勻，用無菌生理鹽水沖洗腸道內(nèi)壁，沖洗干凈后，用滅菌手術(shù)刀片輕輕刮取腸道黏膜，收集于凍存管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rRNA PCR 擴(kuò)增 使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，德國）提取微生物總DNA。16S rRNA V3-V4 區(qū)擴(kuò)增引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3'），其中引物338F 的5'尾端帶有條碼標(biāo)記。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸90 s，22 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測，之后按照每個(gè)樣本的測序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合來構(gòu)建文庫進(jìn)行Miseq 測序。

1.4 測序序列處理 測序得到雙端序列數(shù)據(jù)，根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對的reads 拼接（merge）成一條序列，允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，最小overlap長度為10 bp，篩選掉不合格序列。根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分有效序列，并調(diào)整序列方向，barcode 允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。同時(shí)對reads 的質(zhì)量和merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控，過濾reads尾部質(zhì)量值20 以下的堿基，設(shè)置50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基；并且過濾質(zhì)控后50 bp 以下的reads，去除含N 堿基的reads。

1.5 生物信息學(xué)分析 在97% 相似度下通過Usearch（version 7.1）軟件將序列進(jìn)行聚類，得到分類操作單元（OTUs）。通過RDP Classifer 將OTUs 代表序列與數(shù)據(jù)庫Silva 進(jìn)行比對，置信度閾值為0.6，進(jìn)而分析物種多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)利用序列數(shù)量與其所代表的OTU 數(shù)目來構(gòu)建稀釋曲線，以及利用序列數(shù)量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)來構(gòu)建Shannonwinner 曲線。根據(jù)樣本OTU 數(shù)據(jù)來估計(jì)菌群的α多樣性和β多樣性。α多樣性以物種豐富度指數(shù)（Chao 和Ace）和多樣性指數(shù)（Shannon 和Simpson）表現(xiàn)。對于β多樣性指標(biāo)，計(jì)算加權(quán)和未加權(quán)的UniFrac 距離矩陣，并通過主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行可視化。使用LEfSe 進(jìn)行組間豐度差異的可視化，首先采用非參數(shù)因子Kruskal -Wallis 秩和檢驗(yàn)檢測組間豐度差異顯著的物種，之后對這些物種進(jìn)行成對Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，最后通過線性判別分析（LDA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和評估差異顯著的物種。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件的GLM 程序進(jìn)行方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，并用Met-astats 方法對各處理組間物種差異性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)評價(jià) 如表3 所示，測序共得到有效序列639 041 條，合計(jì)233.84 Mp 堿基，平均序列長度439.01 bp。比對得到564 個(gè)OTUs，覆蓋率達(dá)99.8%以上。各組之間的豐度（OTU、ACE 和Chao1）和多樣性（Shannon 和Simpson）指數(shù)無顯著差異。此外，稀釋曲線及Shannon-winner 曲線隨著測序數(shù)據(jù)量的增加趨于平坦（圖1），表明測序數(shù)據(jù)量已覆蓋樣本中的絕大多數(shù)物種。

圖1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

表3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及多樣性分析

2.2β多樣性分析 如圖2 所示，加權(quán)PcoA 分析顯示處理組明顯聚為兩類（苜蓿組與黑麥組，燕麥組與花生秧組），而非加權(quán)PcoA 分析則顯示處理組無明顯聚類。雖然加權(quán)和非加權(quán)PcoA 分析聚類結(jié)果不一致，但前者PC1+PC2=50.28% 大于后者PC1+PC2=36.36%，說明加權(quán)PcoA 分析結(jié)果較可靠，表明飼糧纖維源對鵝腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)有一定影響，并且苜蓿組與黑麥組、燕麥組與花生秧的影響較為接近。

圖2 腸道微生物β 多樣性分析

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析 分類學(xué)結(jié)果顯示，苜蓿組檢出10門106 屬，黑麥組檢出11 門141 屬，燕麥組檢出9 門99 屬，花生秧組檢出9 門105 屬。門水平上，相對豐度大于1% 的有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），且4 種菌門豐度在各組的占比均高達(dá)97%以上（圖3A）。由表4 可見，苜蓿組厚壁菌門（Firmicutes）高于燕麥組（P＜0.05）；黑麥組放線菌門（Actinobacteria）高于花生秧組（P＜0.05）。

屬水平上，處理組間共有菌屬75 個(gè)，特有菌屬20個(gè)（苜蓿組：5 個(gè)；黑麥組：12 個(gè)；燕麥組：2 個(gè)；花生秧組：1 個(gè)）。擬桿菌屬（Bacteroides）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度之和在各組占比最高（苜蓿：43.67%；黑麥組：33.37%；燕麥組：55.48%；花生秧組：52.58%）（圖3B）。由表4 可見，黑麥組Clostridiales_vadinBB60_group_norank和Turicibacter菌屬高于燕麥組和花生秧組（P＜0.05）；苜蓿組Lachnospiraceae菌屬高于黑麥組和花生秧組（P＜0.05）。

表4 腸道微生物菌群豐度差異 %

圖3 菌群組成分析

2.4 共有和特有菌群分析 如圖4A 所示，苜蓿組、黑麥組、燕麥組和花生秧組共享165 個(gè)OTU，占總OTU數(shù)的63.46%，特有OTU 分別有48、57、32、41 個(gè)。根據(jù)屬分類水平上的注釋和豐度信息，從共享OTU 中選取豐度前50 的屬進(jìn)行層級聚類（圖4B），結(jié)果顯示燕麥組與花生秧組表達(dá)模式相似，與PcoA 分析結(jié)果一致。對特有菌群進(jìn)行LEfSe 分析（圖4C）發(fā)現(xiàn)，花生秧組的代表性細(xì)菌為紅蝽?xiàng)U菌科（Coriobacteriaceae）（LDA＞2），燕麥組的代表性細(xì)菌為硫桿菌屬（Thiobacillus）和 嗜 氫 菌 屬（Hydrogenophilales）（LDA＞2），苜蓿組的代表性細(xì)菌為艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）和胃氣單胞菌（Gastranaerophilales）（LDA＞2.5）。

圖4 共有和特有微生物種群組成分析

3 討 論

飼糧纖維是指不能被非反芻動物消化道內(nèi)源酶降解的多糖和木質(zhì)素，主要成分為非淀粉多糖（纖維素、半纖維素和寡聚糖等）和木質(zhì)素，其中非淀粉多糖占90%以上[14]。研究表明非淀粉多糖是日糧纖維的可消化部分，且不同纖維源飼糧非淀粉多糖消化率存在差異[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同纖維源飼糧可顯著影響4周齡四川白鵝平均日增重，其中添加苜蓿和黑麥草粉可獲得較好的生長性能[13]，這可能是由于不同纖維的組分差異及在腸道內(nèi)的發(fā)酵程度引起的，揭示了纖維與腸道微生物組成之間存在一定關(guān)系。

鵝對纖維的消化主要依賴于腸道微生物代謝所產(chǎn)生的纖維酶，該類似瘤胃的消化方式是鵝消化生理的重要組成部分[7]。腸道微生物的種類、數(shù)量及其平衡性與動物健康及消化功能密切相關(guān)[16]。本研究中不同纖維源飼糧對4 周齡四川白鵝腸道菌群α多樣性指數(shù)無顯著影響，表明纖維類型不會改變腸道微生物組成結(jié)構(gòu)，這與周海柱等[17]報(bào)道一致。β多樣性分析則顯示處理組明顯聚為兩類（苜蓿組與黑麥組，燕麥組與花生秧組），這是由于苜蓿草和黑麥草、燕麥草和花生秧所含中性洗滌纖維和半纖維素的量接近，兩者具有相似腸道發(fā)酵模式。此外，不同草粉所含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量、可溶性、木質(zhì)化程度等不同是導(dǎo)致β多樣性存在差異的重要原因[14,18]。

本試驗(yàn)中，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是四川白鵝腸道微生物的主要菌門，這與Gao 等[19]的報(bào)道基本一致。研究表明，厚壁菌門（Firmicutes）含有大量分解纖維的細(xì)菌[20]。本研究中，苜蓿組厚壁菌門（Firmicutes）顯著高于燕麥組，可能是前者飼糧酸性洗滌纖維含量高于后者，有利于其定植[21]，表明飼糧中添加苜?？捎行Т龠M(jìn)纖維素的分解。此外，黑麥組放線菌門（Actinobacteria）顯著高于花生秧組，可能是前者飼糧高酸性洗滌纖維含量促進(jìn)了放線菌門（Actinobacteria）的增殖[22]。放線菌門（Actinobacteria）能分泌木質(zhì)素酶和抗生素，可有效改善宿主的纖維消化力和機(jī)體免疫力[23]。因此，飼糧中添加黑麥草不僅可提高飼糧適口性，也可提高鵝消化能力和免疫力。

特有菌群LEfSe 分析表明，花生秧組的代表性細(xì)菌為紅蝽?xiàng)U菌科（Coriobacteriaceae），可能與花生秧組飼糧的中性洗滌纖維含量較高有關(guān)，該菌屬于腸桿菌科，嗜中性且耐酸，主要參與膽固醇衍生代謝轉(zhuǎn)化和植物性雌激素的多酚代謝[24]。燕麥組代表性菌群為嗜氫菌科，包括硫桿菌屬（Thiobacillus）和嗜氫菌屬（Hydrogenophilales），前者可一定程度地分解纖維[25-26]。苜蓿組代表性菌群為艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）和胃氣單胞菌（Gastranaerophilales），前者可將阿拉伯木聚糖、纖維二糖、果糖和半乳糖轉(zhuǎn)化為丁酸，而丁酸主要是結(jié)腸細(xì)胞的能量來源，達(dá)到維持結(jié)腸黏膜健康的目的[27]。苜蓿組的可溶性非淀粉多糖含量較高，為艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）提供了充足的代謝底物。

4 結(jié) 論

不同纖維源飼糧對0～4 周齡四川白鵝腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定影響，但主要顯著影響部分菌群相對豐度和特有菌群數(shù)量，尤其是添加苜蓿和黑麥草可改善腸道菌群組成和數(shù)量。因此，在四川白鵝0～4 周齡的飼養(yǎng)過程中可適當(dāng)添加苜蓿或黑麥草。