李 颯，房曉歡，齊雅天，王志剛,2，陶晨雨,2，孫樹春,2*，李俊杰,2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

顆粒細胞作為卵泡的重要組成部分，在維持雌性動物生殖功能中起著重要作用[1]。顆粒細胞的增殖分化可促進卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟等，其凋亡是卵泡閉鎖的主要原因，而其抗氧化能力也有利于保護卵母細胞免受氧化損傷[2-4]。Sirt2 是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）活性的組蛋白去乙?；?，廣泛表達于哺乳動物的多種組織和器官，主要位于細胞質，可使不同底物去乙酰化從而參與多種生物學過程[5-6]。Li 等[7]研究發(fā)現(xiàn)Sirt2 可促進腸道細胞增殖和分化。此外，Sirt2還可調(diào)控細胞凋亡。Xu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)抑制牛老化卵母細胞中的Sirt2 表達可誘導卵母細胞凋亡。Wang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)Sirt2 可使FOXO3a 去乙?；瑥亩せ钛趸瘧l件下細胞的抗氧化防御系統(tǒng)。另有研究表明，Sirt2 能夠參與調(diào)控牛顆粒細胞類固醇激素分泌[10]；在牛卵丘卵母細胞復合體（COCs）中，Sirt2 可參與維持卵丘細胞與卵母細胞間的縫隙連接間信息通訊[11]。但Sirt2 是否在綿羊卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡及抗氧化功能中發(fā)揮調(diào)控作用尚不明確。因此，本研究通過siRNA 干擾的方法敲低綿羊卵巢顆粒細胞Sirt2 表達，檢測細胞增殖情況、凋亡相關基因Caspase-3、Bax、Bcl-2與抗氧化相關基因FoxO3a、SOD2、CAT、GPX4的表達及細胞內(nèi)ROS 水平變化，為進一步研究Sirt2在雌性生殖功能中發(fā)揮的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 胎牛血清（FBS，以色列BI 公司），胰蛋白酶消化液（北京博奧拓達科技有限公司），DPBS（Gibco 公司），DME/F12 培養(yǎng)液（HyClone 公司），臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Lipofectamine RNAi MAX 轉染試劑（Invitrogen 公司），MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），RNA simple 總RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，DCFH-DA（Sigma 公司）。免疫熒光染色所用抗體均為北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 綿羊卵巢顆粒細胞的采集與培養(yǎng) 從保定周邊綿羊定點屠宰場采集新鮮的卵巢，放入盛有37℃左右生理鹽水（含雙抗）的保溫瓶中，4 h 內(nèi)帶回實驗室。將卵巢清洗干凈后，用無菌刀片劃破表面直徑為2～6 mm的卵泡，獲取顆粒細胞，加入含10% FBS 的DME/F12培養(yǎng)液離心清洗，棄上清后加入培養(yǎng)液吹打均勻，接種在培養(yǎng)皿中38.5℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待顆粒細胞匯合度達到70%～80%，胰酶消化后轉入細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

1.2.2 綿羊顆粒細胞鑒定 采用免疫熒光染色法鑒定特異表達于顆粒細胞的促卵泡素受體（FSHR）。顆粒細胞接種于培養(yǎng)板進行細胞爬片，24 h 后用PBS 洗滌3次，每次5 min，免疫染色固定液固定10 min，PBS 洗滌3 次。免疫染色通透液通透10 min，PBS 洗滌3 次。免疫染色封閉液室溫封閉1 h，PBS 洗滌3 次。加入1:200稀釋的一抗，4℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次。加入1:200稀釋的二抗，室溫避光孵育2 h，PBS 洗滌3 次。DAPI染色液染核，室溫孵育5 min，PBS 洗滌3 次?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?，后于熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.2.3 siRNA 的設計與合成 以Sirt2為靶基因，采用RNAi 設計軟件設計siRNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。si-Sirt2和無義序列siRNA（NC）的基因序列見表1。

1.2.4 綿羊卵巢細胞傳代培養(yǎng)及轉染 棄去培養(yǎng)皿內(nèi)原有培養(yǎng)液，用DPBS 清洗3 次，加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，38.5℃消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)絕大部分細胞回縮變圓，細胞間隙變大，并有少量細胞懸浮時，立即加入顆粒細胞培養(yǎng)液終止消化，用1 mL 移液槍輕輕吹打培養(yǎng)皿內(nèi)細胞層，然后將細胞懸液收集到離心管中，1 500 r/min 離心5～8 min，棄上清，洗滌3 次。離心后棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細胞，使用臺盼藍試劑染色計數(shù)，使細胞密度為1×106個/mL，接種于6 孔板上，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，當細胞貼壁率達到60%～80%時進行細胞轉染。轉染按照Lipofectamine RNAi MAX 轉染試劑說明書操作，用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM 分別稀釋Lipofectamine RNAi MAX 和siRNA，將稀釋后的兩者按照1:1 的體積比輕輕混合，室溫靜置5 min，然后將混合液加入細胞培養(yǎng)基中。將綿羊顆粒細胞分組，分別為轉染NC 的對照組、轉染si-Sirt2的干擾組，轉染24、48、72 h 后檢測Sirt2的表達。

1.2.5 RNA 提取 收集轉染后的顆粒細胞儲存于-80℃冰箱，用于RNA 提取。使用總RNA 提取試劑盒提取總RNA。

1.2.6 引物設計及合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知的綿羊各基因序列，利用 Primer Premier 6.0 軟件分別設計Sirt2及內(nèi)參基因β-actin等引物序列，引物序列見表2，均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.7 qRT-PCR 檢測基因表達 按照TaKaRa 反轉錄試劑盒的使用方法將提取的RNA 去除基因組DNA 后進行反轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板，綿羊β-actin為內(nèi)參進行qRT-PCR。反應最佳條件：95℃預變性 2 min；95℃ 變性5 s，60℃退火 30 s，40 個循環(huán)；熔解曲線階段95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。之后進行熔解曲線分析，驗證PCR 產(chǎn)物的純度。根據(jù)閾值循環(huán)（CT）值計算各基因相對于內(nèi)參基因β-actin的表達量。

1.2.8 MTT 法檢測細胞增殖情況 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，將細胞傳代至96 孔板，每個處理3個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6～24 h，當細胞貼壁率達到60%～80%，轉染10 nmol/L siRNA 后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL MTT 溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，然后每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測定各孔的吸光度。

1.2.9 熒光探針DCFH-DA 檢測細胞內(nèi)ROS 將綿羊卵巢顆粒細胞接種到6 孔板，當細胞貼壁率達到60%～80%，轉染10 nmol/L siRNA，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，使用 DME/F12 培養(yǎng)基將DCFH-DA 稀釋為10 μmol/L，每個6 孔板中加入1 mL DCFH-DA，于培養(yǎng)箱孵育30 min，PBS 洗滌3 次，使用熒光顯微鏡觀察并拍照，Image J圖像軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計分析 本實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 進行單因素方差分析和獨立樣本T 檢驗，P＜0.05 表示差異顯著，每個試驗至少3 次重復。

2 結果與分析

2.1 綿羊卵巢顆粒細胞純度鑒定 如圖1 所示，細胞核經(jīng) DAPI 染色呈藍色熒光，F(xiàn)SHR 在綿羊卵巢顆粒細胞的細胞核外周及胞漿中均有表達，呈綠色熒光，證明分離培養(yǎng)的細胞為綿羊卵巢顆粒細胞。鏡下可見的表達率大于90%，表明分離培養(yǎng)的顆粒細胞純度較高，可以進行后續(xù)實驗。

圖1 綿羊卵巢顆粒細胞FSHR 免疫熒光染色（200×）

2.2 si-Sirt2轉染綿羊卵巢顆粒細胞不同時間后的干擾效率 如圖2 所示，10 nmol/L si-Sirt2處理后24、48、72 h 的mRNA 表達量均較對照組顯著降低，干擾效率大于90%，si-Sirt2干擾引物可用于后續(xù)實驗。

圖2 si-Sirt2 轉染綿羊卵巢顆粒細胞不同時間的干擾效率

2.3 干擾Sirt2表達對綿羊卵巢顆粒細胞增殖的影響 如圖3 所示，10 nmol/L si-Sirt2轉染綿羊顆粒細胞24、48、72 h 后，隨著處理時間的延長OD 值增大，細胞數(shù)量不斷增多。對照組和干擾組間均沒有顯著性差異，表明干擾Sirt2表達在24～72 h 對細胞增殖無影響。

圖3 si-Sirt2 處理綿羊卵巢顆粒細胞不同時間后細胞增殖情況

2.4 干擾Sirt2表達對綿羊卵巢顆粒細胞凋亡相關基因表達的影響 如圖4 所示，10 nmol/L si-Sirt2處理綿羊卵巢顆粒細胞24 h 后抗凋亡基因Bcl-2的表達低于對照組（P＜0.05），促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達高于對照組（P＜0.05），表明干擾Sirt2表達對細胞凋亡有誘導作用。

圖4 干擾綿羊卵巢顆粒細胞Sirt2 表達對Bcl-2、Bax、Caspase-3 表達的影響

2.5 干擾Sirt2表達對綿羊卵巢顆粒細胞ROS 水平的影響 如圖5 所示，10 nmol/L si-Sirt2處理綿羊卵巢顆粒細胞24 h 后ROS 的水平高于對照組（P＜0.05）。

圖5 si-Sirt2 處理綿羊卵巢顆粒細胞24 h 后對ROS 水平的影響

2.6 干擾Sirt2表達對綿羊卵巢顆粒細胞抗氧化相關基因表達的影響 如圖6 所示，si-Sirt2處理綿羊卵巢顆粒細胞24 h 后，抗氧化相關基因FoxO3a、SOD2、CAT、GPX4的表達水平均低于對照組（P＜0.05）。

圖6 干擾Sirt2 表達對綿羊卵巢顆粒細胞抗氧化相關基因表達的影響

3 討 論

Sirt2 作為一種高度保守的組蛋白去乙?；福扇ヒ阴；喾N轉錄因子和調(diào)節(jié)蛋白，從而調(diào)控細胞增殖、細胞凋亡及氧化應激等多種生物學過程[12-13]。Li 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腸道細胞中，Sirt2 能夠參與細胞增殖調(diào)控，缺乏Sirt2 不利于小腸上皮細胞的增殖。然而，在人胚腎細胞株293T 細胞中，過表達Sirt2 后可抑制細胞增殖[14]。可見，Sirt2 對細胞增殖的影響可能由于物種特異性、組織特異性及細胞特異性而出現(xiàn)差異。本試驗是首次研究Sirt2 對于綿羊卵巢顆粒細胞增殖的影響，結果表明在72 h 內(nèi)抑制Sirt2 表達對于綿羊卵巢顆粒細胞增殖活性無顯著影響，為今后探究Sirt2 調(diào)控卵泡發(fā)育的機制奠定基礎。

抗凋亡蛋白Bcl-2 是許多生理或病理性細胞凋亡的關鍵性調(diào)節(jié)因素，其可通過影響細胞內(nèi)信息傳導而影響凋亡，對多種因素引發(fā)的細胞凋亡有抑制或延緩作用[15]。Bax 蛋白是與Bcl-2 相關的同源性蛋白，可作為Bcl-2 的拮抗劑。這兩者的比例決定細胞受到刺激后是存活還是凋亡，當Bcl-2 占優(yōu)勢時細胞存活；Bax 占優(yōu)勢則細胞凋亡[16]。Caspase-3 作為凋亡途徑下游導致底物酶解的蛋白酶，是細胞凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行者。Xu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在牛老化卵母細胞中抑制Sirt2表達，可通過增加自噬活性而上調(diào)Caspase-3 活性，從而導致老化卵母細胞凋亡。在神經(jīng)膠質瘤細胞模型中，Sirt2的化學抑制或siRNA 干擾均可誘導膠質瘤細胞壞死和Caspase-3 依賴性凋亡[17]。同樣，本研究中，干擾綿羊顆粒細胞Sirt2表達后，可通過升高促凋亡基因Bax的表達，降低抑凋亡基因Bcl-2的表達，從而上調(diào)Caspase-3表達，誘導細胞凋亡，表明Sirt2 在細胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

顆粒細胞在代謝過程中會產(chǎn)生大量的ROS，其可通過自身的抗氧化系統(tǒng)使ROS 維持在一個較低的水平。當機體發(fā)生氧化應激時，累積的ROS 可激活多條信號通路，調(diào)控FoxO3a 的活性與功能。FoxO3a 轉錄因子作為ROS 感受器，也是氧化應激反應的中介，F(xiàn)oxO3a被激活后可誘導下游抗氧化基因表達[18]。本研究結果表明，當干擾Sirt2表達后，綿羊卵巢細胞內(nèi)ROS 水平顯著上升，F(xiàn)oxO3a轉錄因子和抗氧化基因CAT、GPX4和SOD2表達均顯著降低，表明顆粒細胞的抗氧化功能減弱。Xu 等[19]也發(fā)現(xiàn)，抑制牛卵母細胞中Sirt2 的表達可增加FoxO3a 的乙?；?，降低其下游抗氧化基因SOD2和CAT的表達，導致氧化還原穩(wěn)態(tài)的紊亂。而過表達Sirt2 時，可通過抗氧化防御保護老化的卵母細胞免受氧化應激損傷[20]。Wang 等[9]研究也發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導的細胞損傷中，Sirt2 蛋白可以進入細胞核與FoxO3a 結合并使FoxO3a 去乙?；黾覨oxO3a與DNA 的結合力，并提高SOD2 的表達，從而利于細胞的存活。以上研究均表明Sirt2 在氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著積極作用。

4 結 論

綜上所述，干擾綿羊顆粒細胞Sirt2表達，不會影響細胞增殖，但會促進細胞凋亡并對細胞抗氧化能力產(chǎn)生不利影響。