趙金艷，權(quán) 凱，王 俊 ,王先寧，尹慧茹，李 君，哈斯通拉嘎，王擁慶，韓浩園*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.沈丘縣農(nóng)牧科技研發(fā)中心，河南周口 466300）

山羊?qū)儆隈Z化較早的牲畜之一。山羊群體具有多母系起源，遺傳多樣性豐富。家養(yǎng)山羊（Capra hircus）由野生山羊進化而來，捻角野山羊（C.aegagrus）和旋角野山羊（C.falconeri）被認為是家養(yǎng)山羊的兩大野生祖先。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是動物唯一的核外遺傳物質(zhì)，遵循嚴格的母系遺傳[1]。其中，片段長度為1 220 bp 的D-環(huán)控制區(qū)（D-loop）受自然選擇影響較大，存在巨大變異，所以廣泛應(yīng)用于哺乳動物群體遺傳多樣性、物種親緣關(guān)系和種群間系統(tǒng)進化等方面的研究[2]。Naderi 等[3]發(fā)現(xiàn)7 個高度分化的線粒體單倍型分支（A、B1、B2、C、D、F、G）。

我國擁有豐富的山羊品種資源，長期的自然選擇和人工選擇可能是導(dǎo)致南北地區(qū)家養(yǎng)山羊遺傳多樣性和種質(zhì)分化的主要原因。中部地區(qū)地方山羊品種豐富，有山西省太行黑山羊、山東省濟寧青山羊、河南省伏牛白山羊、槐山羊和堯山白山羊等。其中，太行黑山羊是極其珍貴的食品資源，對飼養(yǎng)環(huán)境有較強的適應(yīng)性，放牧、圈養(yǎng)均能適應(yīng)，尤其是肉質(zhì)美味可口，目前由于個體小、生長慢、屠宰率低等原因群體數(shù)量急劇減少[4]；濟寧青山羊是優(yōu)良的羔皮用山羊品種，具有性成熟早、多胎多羔、常年發(fā)情、抗病力強等優(yōu)良種質(zhì)特性，近年來，濟寧青山羊由于受體型瘦小、生長速度緩慢等缺點的限制，純種處于瀕危狀態(tài)[5-6]；伏牛白山羊具有產(chǎn)肉性能好、屠宰率高、繁殖性能好、耐粗飼、抗病力強、適宜山地放牧等優(yōu)點；槐山羊具有適應(yīng)性強、繁殖力強、抗病力強、肉質(zhì)鮮美、皮張質(zhì)量好等優(yōu)點；堯山白山羊是肉皮兼用型山羊品種，具有個體大、抗病力強、四肢粗壯、屠宰率高等特性，尤其是肉質(zhì)膻味較輕而備受當?shù)叵M者青睞，近年來開展肉羊雜交，純種堯山白山羊分布區(qū)域縮小、數(shù)量銳減[7]。由于市場競爭、雜化等各種原因，這些品種數(shù)量近年來均有下降，為了保護山羊本地品種種質(zhì)資源的多樣性，有必要系統(tǒng)開展中部地區(qū)山羊品種群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多態(tài)性的研究，為中部地區(qū)山羊群體種質(zhì)的穩(wěn)定、持續(xù)發(fā)展奠定理論研究基礎(chǔ)。

本研究對中部地區(qū)的伏牛白山羊、槐山羊、濟寧青山羊、太行黑山羊和堯山白山羊的線粒體D-loop 區(qū)遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及母系起源進行研究，旨在為中國中部地區(qū)山羊地方品種資源的評估、保護、利用及山羊品種起源、進化研究等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 本研究共采集145 個本地山羊品種外周血液樣本，包括20 個伏牛白山羊、74 個槐山羊、28 個濟寧青山羊、13 個太行黑山羊、10 個堯山白山羊，采集樣本的羊只年齡段為6 月齡至4 歲，隨機采集各品種保種場的雌、雄山羊個體，樣本采集后置于-20℃保存。

1.2 血液總DNA 提取 采用北京艾德萊生物科技有限公司動物基因組DNA 提取試劑盒提取山羊外周血基因組DNA，利用Thermo Nanodrop 1000 檢測OD260/OD280與DNA 濃度，稀釋至20 ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 山羊D-loop 區(qū)序列PCR 擴增 山羊線粒體D-loop區(qū)上游引物（5'-AACCACTATTAACCACATCTA-3'）和下游引物（5'-CACTTACCATGTAAAAGACCC-3'）序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴增體系為25 μL：1 μL DNA 模板、1 μL 上/ 下游引物（10 μmol/L）、9.5 μL ddH2O、12.5 μL TaqPCR Master Mix（北京康為世紀生物科技有限公司）。PCR 擴增程序為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，36 個循環(huán)；72℃延伸9 min，4℃保存。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 利用Lasergene 軟件包SeqMan 軟件拼接雙向測序的序列，利用MEGA 6.0 軟件[8]進行多重比對分析。下載9 條參考序列：旋角野山羊（AB044305）、捻角野山羊（AB004076）、Lineage A（AY155721）、Lineage B（DQ121578）、Lineage C（DQ188892）、Lineage D（AY155952）、Lineage D（DQ188893）、Lineage F（DQ241349）、Lineage G（EF618084），利用MEGA6.0 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗重復(fù)數(shù)為1 000，并基于Kimura 2-parameter（K2P）模型[9]計算濟寧青山羊、伏牛白山羊、太行黑山羊、槐山羊和堯山白山羊間遺傳距離。

利用DnaSP V5 軟件進行5 個山羊品種線粒體D-loop 區(qū)遺傳多態(tài)性分析、單倍型分析、品種間遺傳分化、基因流分析和中性檢驗[10]，利用NETWORK 10.2.0.0 軟件（Fluxus Technology Ltd.,Kiel,Germany）構(gòu)建濟寧青山羊、伏牛白山羊、太行黑山羊、槐山羊和堯山白山羊單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多態(tài)性分析 本研究對槐山羊、太行黑山羊、濟寧青山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊線粒體D-loop遺傳多樣性進行分析，總位點數(shù)為1 138 bp，缺失位點為156 個，用于計算遺傳多樣度的位點為982 個（不包括缺失位點），其中，多態(tài)位點140 個（排除缺失位點），單態(tài)位點842 個。突變位點共定義63 個單倍型，其中，9 個（Hap 3、5、8、13、16、20、26、30、33）為 共享單倍型，品種特異單倍型為54 個。由表1 可知，5 個山羊品種總單倍型多樣度（Hd）為0.965±0.004，核苷酸多樣度（Pi）為0.013 88±0.000 66，研究發(fā)現(xiàn)伏牛白山羊的單倍型多樣度最低（0.831），槐山羊的單倍型多樣度最高（0.957），太行黑山羊的核苷酸多樣度最低（0.011 93），濟寧青山羊的核苷酸多樣度最高（0.014 34）。

表1 5 個山羊品種線粒體D-loop 遺傳多態(tài)性分析

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析 本研究將捻角野山羊、旋角野山羊和6 個D-loop 分支（Lineage A、B、C、D、F、G）作為參考序列，構(gòu)建濟寧青山羊、太行黑山羊、槐山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊系統(tǒng)進化樹（圖1、2），結(jié)果表明5 個山羊品種與捻角野山羊聚類，說明本研究的5 個山羊品種母系起源為捻角野山羊；大部分山羊個體（130 個）屬于支系A(chǔ)（Lineage A），極少數(shù)個體（15個）屬于支系B（Lineage B）；支系A(chǔ) 包括濟寧青山羊、太行黑山羊、槐山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊，支系B 包括濟寧青山羊、槐山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊。如表2 所示，5 個品種間遺傳距離為0.013 6～0.018 8，均未達到亞種間遺傳距離。伏牛白山羊與其他4 個品種的親緣關(guān)系相對較遠，與濟寧青山羊親緣關(guān)系最遠，堯山白山羊與其他4 個品種的親緣關(guān)系相對較近。

表2 5 個山羊品種間遺傳距離

圖1 5 個山羊品種系統(tǒng)進化樹原始樹

2.3 群體遺傳分化分析 遺傳分化結(jié)果如表3 所示，品種間核苷酸平均差異數(shù)（Kxy）為11.406 8～16.242 9，遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.016 6～0.169 3，核苷酸歧異度（Dxy）為0.011 6～0.016 5。伏牛白山羊與濟寧青山羊間的Kxy和Dxy最大，說明2 個品種間核苷酸差異最大，遺傳關(guān)系最遠，與遺傳距離結(jié)果一致。伏牛白山羊與堯山白山羊和太行黑山羊間Fst達到明顯分化程度，其他品種間均為中度分化或分化程度很弱，槐山羊與濟寧青山羊和堯山白山羊、濟寧青山羊與堯山白山羊之間均分化程度很弱，說明品種間存在基因交流，與基因流（Nm）為3.92 的結(jié)果一致。

表3 品種間遺傳分化系數(shù)

2.4 群體擴張分析 由表4 可知，中性檢驗結(jié)果表明伏牛白山羊、濟寧青山羊和太行黑山羊Fu and Li's F 檢驗結(jié)果為正值，且顯著偏離中性，表明伏牛白山羊、濟寧青山羊和太行黑山羊近期經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)和平衡選擇。槐山羊和堯山白山羊Fu and Li's F 檢驗均為P＞0.10，不顯著，符合動態(tài)平衡，未出現(xiàn)群體大規(guī)模擴張或瓶頸現(xiàn)象，群體大小保持相對穩(wěn)定。

表4 5 個山羊品種群體擴張中性檢驗結(jié)果

2.5 群體單倍型及母系起源分析 如表1 所示，本研究共發(fā)現(xiàn)63 個單倍型，共有單倍型為9 個，品種特異單倍型為54 個，槐山羊單倍型最多，為37 個，濟寧青山羊定義16 個單倍型，太行黑山羊與堯山白山羊均為9 個單倍型，伏牛白山羊單倍型最少為7 個。由圖3 可知，63 個單倍型可分為2 個單倍群（Haplogroup A 和Haplogroup B），分別對應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育樹中的支系A(chǔ) 和支系B，說明濟寧青山羊、槐山羊和伏牛白山羊存在2 個母系起源（支系A(chǔ) 和支系B），堯山白山羊和太行黑山羊為單個母系起源（支系A(chǔ)）。且每個支系呈現(xiàn)“星狀”，分布清晰，沒有交叉。

圖3 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

3.1 中部地區(qū)山羊遺傳多樣性Hd和Pi是評價群體遺傳多樣性和分化的重要指標[11]。本研究發(fā)現(xiàn)5 個山羊品 種 總Hd為0.965±0.004，Pi為0.013 88±0.000 66。其中，太行黑山羊Hd為0.886，Pi為0.01193。閆益波等[4]研究發(fā)現(xiàn)太行黑山羊Hd值為0.998；武建亮等[12]研究結(jié)果為0.800 3。本研究結(jié)果位于這2 個數(shù)值之間，說明山西太行黑山羊群體多態(tài)性較高，近年來群體遺傳多樣度較為豐富，并維持穩(wěn)定，具有一定的選擇潛力。本研究中伏牛白山羊Hd為0.831，Pi為0.017 63，與李婉濤等[13]人發(fā)現(xiàn)的伏牛白山羊群體線粒體D-loop 區(qū)存在著豐富的多態(tài)性結(jié)果一致。濟寧青山羊在5 個品種中遺傳多樣度較高，Hd為0.930，Pi為0.013 20，遺傳多樣性信息豐富，提供的遺傳信息量大，這可能與品種選育過程中育種群體導(dǎo)入了外血、群體選育時間短等因素有關(guān)[14]。

圖2 5 個山羊品種系統(tǒng)進化樹自展一致樹

郝榮超等[15]曾對中國南部地區(qū)家養(yǎng)山羊遺傳多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)南部地區(qū)家養(yǎng)山羊平均Hd和平均Pi分別為0.954 和0.019 57，西北地區(qū)山羊分別為0.919和0.019 08，與本研究中原地區(qū)山羊品種遺傳多樣性相近。有研究針對河南5 個地方山羊品種的遺傳多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)河南省地方山羊的變異主要存在于品種內(nèi)，品種間的變異相對較小，有足夠的遺傳變異適應(yīng)環(huán)境的變化和人們的選擇需要[16]。

3.2 群體結(jié)構(gòu)分析 本研究遺傳距離結(jié)果表明5 個品種間遺傳距離為0.013 6～0.018 8，郝榮超等[15]發(fā)現(xiàn)西北地區(qū)山羊品種間遺傳距離為0.016～0.019，南部地區(qū)品種間遺傳距離為0.017～0.025，說明中原地區(qū)山羊品種間遺傳距離較近，品種間交流較南方和西北地區(qū)更頻繁。本研究結(jié)果顯示太行黑山羊與其他4 個品種間的遺傳距離范圍為0.014 2～0.018 0，均未達到亞種間遺傳距離。閆益波等[4]研究表明山西太行黑山羊與槐山羊的遺傳距離為0.014，山西太行黑山羊和槐山羊分布的東北和華東地區(qū)冬季寒冷，對毛皮性狀具有較大的選種要求，這2 個品種都以產(chǎn)絨性狀和板皮性狀為優(yōu)，因而群體間起源較近。

Fst可以反映群體近交或群體間遺傳分化程度。本研究中除伏牛白山羊與太行黑山羊、堯山白山羊之間達到明顯分化，其他品種間Fst為0.016 6～0.122 0，說明群體間的遺傳分化水平低，而且基因流大于1，均質(zhì)化作用強，能夠抵制遺傳漂變作用，防止群體間遺傳分化發(fā)生。王可等[6]也發(fā)現(xiàn)濟寧青山羊的遺傳多樣性得到了保留，群體間的基因流較大，遺傳分化水平較低。閆益波等[4]發(fā)現(xiàn)山西太行黑山羊與槐山羊的群體間分化程度較低，均與本研究結(jié)果一致。有研究對中國其他地區(qū)山羊品種遺傳分化進行研究，F(xiàn)st與本研究結(jié)果范圍一致[16-17]。

3.3 母系起源分析 李祥龍等[18]發(fā)現(xiàn)，家養(yǎng)山羊中既有彎角也有旋角，因此認為捻角野山羊和旋角野山羊都是家養(yǎng)山羊的野生祖先。實際上由于捻角野山羊的地理分布與山羊最初家養(yǎng)的地方有高度的相關(guān)性，所以捻角野山羊是最可能的候選者[19]。本研究發(fā)現(xiàn)槐山羊、濟寧青山羊、伏牛白山羊、太行黑山羊和堯山白山羊均與捻角野山羊聚為一類，旋角野山羊單獨聚類。本研究結(jié)果與其他中國家養(yǎng)山羊母系起源進化研究結(jié)果一致[15,20]，均認為捻角野山羊是中國家養(yǎng)山羊的野生祖先。

中國山羊品種存在A、B、C 和D 4 個分支[21]，A和B 是在我國山羊品種中廣泛存在的類型，且經(jīng)歷過群體擴張，而類型C 和D 則以低頻率存在于我國部分山羊個體中[15,22]，本研究印證了這些觀點。本研究聚類發(fā)現(xiàn)，中原地區(qū)山羊共分為兩大支系，支系A(chǔ) 和支系B，且槐山羊、濟寧青山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊在A、B 支系均有分布。而太行黑山羊僅來源于支系A(chǔ)。當然，要澄清山羊的起源進化問題，可能僅有mtDNA D-loop標記是不夠的，必須借助其他遺傳標記研究。

4 結(jié) 論

中原地區(qū)5 個山羊品種線粒體D-loop 區(qū)單倍型多樣度與核苷酸多樣度較高，品種間均未達到亞種間遺傳距離，伏牛白山羊、濟寧青山羊和太行黑山羊近期經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)，槐山羊和堯山白山羊符合動態(tài)平衡。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，中原地區(qū)山羊祖先為捻角野山羊，有支系A(chǔ) 和支系B 2 個母系起源。