康賽紅，王文義，王國(guó)春，朱延旭，賀延玉*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.巴彥勒爾市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥勒爾 015000；3.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧遼陽(yáng) 110032）

山羊絨是世界上珍貴的動(dòng)物纖維，具有潔白、光澤、明亮、纖維柔軟等特點(diǎn)，屬高檔紡織原料，被譽(yù)為天然纖維中的一顆明珠[1]。絨毛是次級(jí)毛囊產(chǎn)物，次級(jí)毛囊為可再生器官，以復(fù)雜可循環(huán)式的結(jié)構(gòu)控制絨毛生長(zhǎng)。絨山羊的毛囊發(fā)育分為生長(zhǎng)前期、生長(zhǎng)期、衰退前期、衰退期、靜止期5 個(gè)時(shí)期[2]。在毛囊發(fā)育過(guò)程中，一系列信號(hào)分子在真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞之間相互穿梭，其中包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）家族、同源異型框基因（Homobox，HOX）家族、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、熱休克蛋白（Heatshockprotein，HSP）家族等[3]。安國(guó)仁[4]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境會(huì)影響絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)因子的分布和產(chǎn)絨性能，將遼寧絨山羊引進(jìn)到四川金川縣后，遼寧絨山羊產(chǎn)絨量與在原產(chǎn)地差異不大，但是羊絨的細(xì)度比原產(chǎn)地細(xì)，說(shuō)明環(huán)境對(duì)絨山羊的絨毛生長(zhǎng)性能有一定影響。本實(shí)驗(yàn)主要研究絨山羊次級(jí)毛囊發(fā)育相關(guān)基因在不同牧場(chǎng)環(huán)境絨山羊皮膚組織中的表達(dá)與定位，探究基因表達(dá)與牧場(chǎng)環(huán)境之間的關(guān)系，為絨山羊產(chǎn)絨性能的差異提供組織形態(tài)學(xué)方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控絨毛生長(zhǎng)及加快絨山羊育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為來(lái)源于遼寧省遼陽(yáng)市某種羊場(chǎng)的遼寧絨山羊和來(lái)自于內(nèi)蒙古巴彥勒爾市某種羊場(chǎng)的內(nèi)蒙古絨山羊，以及由原產(chǎn)地引入到甘肅慶陽(yáng)市環(huán)縣2 年及以上的2 種絨山羊。分別于2020 年8月采取絨山羊皮膚樣品（2 歲4 只）。采樣部位為體右側(cè)肩胛骨后沿背中線(xiàn)與腹中線(xiàn)的上1/3 處，取1 cm2左右的體側(cè)皮膚固定于4%的多聚甲醛中，切取1 mm2的皮膚組織放入2.5%的戊二醛固定液中備用。再取100 mg 左右皮膚組織放在固定裝有RNA 保存液的凍存管進(jìn)行短暫保存，之后帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 Trizol 法提取所用試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix 購(gòu)自TOYOBO 公司；PCR Master Mix 購(gòu)自康為世紀(jì)公司；DL2000DNA Marker、瓊脂糖、6×DNA loading Buffer 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒購(gòu)自上海生工生物股份有限公司；超凈工作臺(tái)、低溫離心機(jī)、電泳儀、核算蛋白測(cè)定儀、PCR 儀、熒光定量PCR 儀購(gòu)自濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（德國(guó)）；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國(guó) MediaCybernetics公司）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 上公布的山羊HSP27基因（登錄號(hào)：NT_037436.4）、BMP2基因（登錄號(hào)：EU854584.1）序列，用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參基因。引物均由西安擎科生物有限公司合成，具體信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 透射電鏡實(shí)驗(yàn) 取2 歲遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊與引入到環(huán)縣的2 種絨山羊的皮膚組織放入2.5%的戊二醛固定液中固定后，制作大小為70 nm 的超薄切片，鉛染和鈾染之后，在透射顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察。

1.5 總RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法提取羊皮膚樣品中總RNA，稱(chēng)100 g 組織樣品放在預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，成粉末狀后裝入1.5 mL 的無(wú)RNA 的離心管中，后續(xù)步驟按照Trizol 法提取步驟進(jìn)行。所得總RNA 用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性并用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 合成。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA 為模板，以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用SYBR 熒光染料方法，對(duì)目的基因HSP27、BMP2進(jìn)行相對(duì)定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，RNase 游離H2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s；95℃變性15 s；60℃退火15 s；72℃延伸45 s；共40 個(gè)循環(huán)。

1.7 免疫組化實(shí)驗(yàn) 制作石蠟切片，采用免疫組化sp 法染色，過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用 BA200Digital 數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR 重復(fù)樣品間Ct 值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism5 進(jìn)行分析作圖，并采用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，差異顯著為P＜0.05，差異極顯著為P＜0.01；采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定所采集全部圖像的光密度（Integrated optical density，IOD）和面積，并計(jì)算每張圖像的平均光密度（Mean Density，MD），使用3 張圖像的平均光密度再計(jì)算平均數(shù)，得出每例樣本的平均光密度，使用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取結(jié)果 所提總RNA 吸取1 μL 用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)其純度進(jìn)行測(cè)定，所有樣品的A260/A280值均在1.8～2.0，總RNA 濃度適中，純度較高，完全適合進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 透射電鏡結(jié)果 在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)（圖1），此時(shí)次級(jí)毛囊外根鞘進(jìn)一步增厚，細(xì)胞增大；毛囊內(nèi)根鞘結(jié)構(gòu)層次清晰，赫胥黎層層數(shù)較多，出現(xiàn)亨勒層；毛囊結(jié)構(gòu)較完整，說(shuō)明此時(shí)毛囊處于發(fā)育旺盛時(shí)期。

圖1 不同地域絨山羊次級(jí)毛囊透射電鏡結(jié)果

2.3 RT-PCR 結(jié)果 由圖2 可知，原產(chǎn)地絨山羊與引入地絨山羊BMP2mRNA 與HSP27mRNA 在同一時(shí)期的絨山羊毛囊組織中均有表達(dá)，以原產(chǎn)地絨山羊?yàn)閷?duì)照組，遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊引入到環(huán)縣后，HSP27基因表達(dá)量在兩地之間差異顯著，但BMP2基因差異不顯著。

圖2 2 歲絨山羊皮膚毛囊中BMP2、HSP27 基因qPCR 表達(dá)結(jié)果

2.4 免疫組化結(jié)果

2.4.1 BMP2 蛋白在2 歲原產(chǎn)地與引入到環(huán)縣的遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊皮膚組織中的表達(dá)分布 免疫組化DAB 呈色后產(chǎn)物顯示為棕色，深棕色表示強(qiáng)陽(yáng)性，棕色表示中等陽(yáng)性，淺棕色表示弱陽(yáng)性。如圖3 所示，BMP2 蛋白在2 歲原產(chǎn)地與引入地絨山羊皮膚組織中均呈弱陽(yáng)性表達(dá)，BMP2 蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)、表皮層、次級(jí)毛囊的內(nèi)根鞘以及毛乳頭也呈弱陽(yáng)性表達(dá)。

圖3 BMP2 蛋白在不同地域環(huán)境2 歲絨山羊體側(cè)皮膚組織中的表達(dá)

2.4.2 HSP27 蛋白在2 歲原產(chǎn)地與引入到環(huán)縣的遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊皮膚組織中的表達(dá)分布 通過(guò)免疫組化DAB 顯色后發(fā)現(xiàn)HSP27 蛋白在不同牧場(chǎng)環(huán)境絨山羊皮膚組織中都有表達(dá)，如圖4 所示，HSP27 蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間質(zhì)及表皮層中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在次級(jí)毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘、毛乳頭處呈弱陽(yáng)性表達(dá)。

圖4 HSP27 蛋白在不同地域環(huán)境2 歲絨山羊體側(cè)皮膚組織中的表達(dá)

2.4.3 BMP2、HSP27 蛋白在不同地域絨山羊皮膚毛囊中光密度值比較 由圖5 可知，BMP2、HSP27 蛋白的光密度值在不同地域存在差異，且2 種蛋白在引入地絨山羊次級(jí)毛囊中的平均光密度值都低于原產(chǎn)地絨山羊的平均光密度值。

圖5 BMP2、HSP27 蛋白在不同地域環(huán)境絨山羊體側(cè)皮膚組織中平均光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討 論

毛囊作為哺乳動(dòng)物唯一像生物鐘的周期性型器官，其發(fā)育受到多種基因分子信號(hào)的調(diào)控[5]。HSP 作為一種分子伴侶，在動(dòng)物毛囊發(fā)育過(guò)程中主要起調(diào)節(jié)作用，功能是抑制細(xì)胞的凋亡、保護(hù)細(xì)胞等，集中體現(xiàn)在細(xì)胞的生理生化功能方面[6]。HSP27 在皮膚發(fā)育過(guò)程中表達(dá)從表皮脫落和角化開(kāi)始，在毛囊中，HSP27 可以在外根鞘最內(nèi)層的細(xì)胞層和突起的角質(zhì)形成細(xì)胞中檢測(cè)到。李婷婷等[7]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)毛囊周期中HSP27 在皮膚的表達(dá)量由高到低依次為生長(zhǎng)期、退行期、休止期[8]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP27 蛋白高表達(dá)于毛囊生長(zhǎng)期。賀延玉[9]等對(duì)隴東絨山羊毛囊的研究表明，HSP27 在毛囊的毛干和內(nèi)根鞘表達(dá)，生長(zhǎng)期的表達(dá)量高于衰退期和休止期，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下絨山羊毛囊中HSP27 蛋白不但在外根鞘表達(dá)，在內(nèi)根鞘、毛乳頭也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明環(huán)境有可能影響其蛋白的表達(dá)定位，需進(jìn)一步驗(yàn)證。BMP作為毛囊誘導(dǎo)抑制物，對(duì)于動(dòng)物的毛囊形成和發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[10]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于毛囊發(fā)育的研究主要集中在人和小鼠上，BMP 及其受體和BMP 拮抗劑表現(xiàn)出嚴(yán)格的時(shí)空表達(dá)模式，以實(shí)現(xiàn)對(duì)表皮和毛囊中細(xì)胞增殖和分化的適當(dāng)調(diào)控[11]。BMP 信號(hào)在毛囊（Hair Follicle，HF）形態(tài)變化、毛囊再生和控制HF 周期中起重要作用，通過(guò)體外表達(dá)BMP4 或靶向滅活BMP 拮抗劑增強(qiáng)BMP 信號(hào)激活，導(dǎo)致HF 誘導(dǎo)發(fā)生[12]。外源性BMPs 的相互作用刺激跨膜受體BMPR1A 磷酸化，細(xì)胞外BMP 抑制劑Noggin 通過(guò)間充質(zhì)表達(dá)，誘導(dǎo)胚胎卵泡形態(tài)發(fā)生，促進(jìn)新生后HF 生長(zhǎng)[13]。BMP2基因是毛囊發(fā)育過(guò)程中主要的信號(hào)分子之一，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在不同地域環(huán)境中表達(dá)有差異，但主要表達(dá)于次級(jí)毛囊的內(nèi)根鞘，這與宋亮麗[14]在牦牛毛囊周期性發(fā)育相關(guān)蛋白的研究中獲得的結(jié)果不一致，可能絨山羊與牦牛毛囊發(fā)育有一定的差異性，也可能是由生活環(huán)境改變引起的變化，有待進(jìn)一步證實(shí)。

遼寧絨山羊生活在我國(guó)東北，降水量多，氣候溫和，溫差較小，海拔大約在100 m 以下；內(nèi)蒙古絨山羊生存環(huán)境干燥，平均海拔在1 000 m 以上，夏日酷熱，冬季漫長(zhǎng)嚴(yán)寒，年降水總量達(dá)262.9 mm，年日照數(shù)大于2 700 h；而甘肅環(huán)縣地處西北，空氣干燥，溫差較大，年降水量300 mm 左右，海拔在885～2 089 m，紫外線(xiàn)強(qiáng)。不同的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)絨山羊的絨品質(zhì)產(chǎn)量有一定影響。張丹[15]對(duì)在不同海拔地區(qū)的西藏絨山羊皮膚相關(guān)基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，高海拔地區(qū)的產(chǎn)絨量整體高于特高海拔地區(qū)，說(shuō)明地域環(huán)境對(duì)絨山羊絨毛生長(zhǎng)、產(chǎn)絨量以及影響毛囊發(fā)育核心因子的表達(dá)是有一定影響的。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，2 歲遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊從原產(chǎn)地引入到環(huán)縣后，BMP2、HSP27基因在其皮膚組織中的表達(dá)定位存在差異，說(shuō)明改變牧場(chǎng)環(huán)境可以影響絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)因子的表達(dá)與定位。