湯穆浛， 盧俊江， 韓敦正

（1廣州市紅十字會醫(yī)院急診科，廣東廣州 510220；2廣州市胸科醫(yī)院，廣東廣州 510095；3廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內科，廣東廣州 510120）

骨髓來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有容易獲取、擴增的特點，同時有著較低的免疫原性和免疫調節(jié)能力，現(xiàn)已用于心肌病和心肌梗死等多種心臟疾病的心肌修復與再生，是治療心血管疾病的理想種子細胞［1］。然而，MSCs 在移植體內的低分化率與低存活率一直制約著它的臨床應用。國內外的研究及本課題組前期研究已證實，組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）基因的表達與MSCs向心肌樣細胞分化關系密切，將HDAC1基因敲除可以誘導MSCs 向心肌樣細胞分化［2-4］。但是，HDAC1 蛋白也被報道參與了低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的乙酰化修飾，沉默HDAC1基因可引起HIF-1α 降解［5-6］，并影響細胞旁分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的功能，降低MSCs 移植后的存活率。為解決上述問題，本研究用重組腺病毒HIF-1α三突變體（recombinant adenovirus containing triple-point mutantHIF1-αgene，Ad-HIF-1α-trip）感染的方法使HDAC1沉默的MSCs中HIF-1α 表達上調，從而改善MSCs旁分泌VEGF的功能。

HIF-1α是缺血缺氧發(fā)生時維持細胞生存非常重要的分子，可激活下游靶基因包括多種促血管生長因子如VEGF、轉化生長因子及其受體基因啟動子上的缺氧反應元件，從而啟動血管新生過程，提高對缺氧環(huán)境的適應性，增強酵解過程，為細胞提供更多的能量［7］。此外，HIF-1α 是組織細胞在低氧狀態(tài)下激活相應基因轉錄的核心調節(jié)因子之一，其最主要的下游基因VEGF［8］是MSCs 參與心梗后修復過程中最重要的旁分泌因子之一。在缺血缺氧條件下，VEGF的表達上調能改善機體血管形成與側支微循環(huán)建立，有利于MSCs在移植體內的生存及心梗后心功能的恢復。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級4～6周齡SD雄性大鼠32只，體重（200±20）g，合格證書編號SCXK（粵）2008-0002，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。MSCs 由大鼠股骨中分離提取，連續(xù)傳代3代以上。

1.2 干擾載體病毒 攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因和HDAC1-shRNA 的慢病毒、攜帶GFP基因的慢病毒空載體及腺病毒空載體均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。構建的Ad-HIF-1α-trip 由南方醫(yī)科大學心血管內科實驗室提供，突變的3個位點分別為：將HIF-1α 的氧依賴性降解結構域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）第402 和564 位脯氨酸（Pro）密碼子CCA 和CCC均突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCA；將HIF-1α的轉錄激活區(qū)第803 位天冬酰胺（Asn）密碼子AAT 突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCA。在HEK293A 細胞中擴增、純化得到Ad-HIF-1α-trip［9］。

1.3 試劑與儀器 兔抗大鼠HDAC1 抗體和兔抗大鼠HIF-1α 單克隆抗體（Abcam）；兔抗大鼠VEGF 單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒和熒光定量SYBR Premix Ex Taq PCR 試劑盒（TaKaRa）。PCR 儀（Bio-Rad）；MX3000P 熒光定量PCR擴增儀（Stratgene）。

2 實驗方法

2.1 全骨髓貼壁法提取大鼠骨髓MSCs 并予以HDAC1-shRNA 慢病毒感染（參考前期實驗）［4-5］無菌條件下迅速剝離大鼠股骨與脛骨，清除骨表面附著組織包括肌肉組織，剪刀在骨兩端橫行剪出小口，DMEM 培養(yǎng)液反復沖洗骨髓并收集骨髓沖洗液，置離心機560×g離心30 min 后棄上清，再加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)液懸浮細胞，接種至T-25 cm2塑料培養(yǎng)瓶內進行培養(yǎng)。

2.2 嘌呤霉素篩選獲得HDAC1基因沉默的大鼠MSCs 穩(wěn) 定 細 胞 株（HDAC1-shRNA-MSCs） 骨 髓MSCs 原代培養(yǎng)初期，約4 h 后出現(xiàn)貼壁細胞，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)漸趨均一穩(wěn)定，排列可呈魚群狀或旋渦狀（圖1A）。HDAC1-shRNA 慢病毒感染（MOI=100）24 h 后于熒光顯微鏡下可觀測到GFP 表達（圖1B）。再以不同濃度梯度（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 和4.5 mg/L）的嘌呤霉素進行篩選，當藥物濃度為0～2 mg/L 時仍有MSCs存活，而濃度大于2 mg/L 時MSCs 全部死亡，所以最終選用2 mg/L 嘌呤霉素篩選目的細胞，構建HDAC1-shRNA-MSCs（圖1C）。

2.3 RT-qPCR 檢測HDAC1-shRNA-MSCs 中HDAC1

的mRNA 表達 為確定獲得的HDAC1-shRNA-MSCs其HDAC1基因表達已被沉默，行RT-qPCR 檢測其mRNA 表達情況，以正常MSCs 及慢病毒空載體感染后的MSCs作為對照組。提取細胞中的總RNA，以其中的mRNA 作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA，再進行熒光定量PCR。HDAC1 的 上 游 引 物 序 列 為5′-TCACCGAATCCGAATGACTCATAA-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-CTGGGCGAATAGAACGCAAGA-3′；內 參 照GADPH 的上游引物序列為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。熒 光 定 量PCR 參 數(shù)：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃3 s，72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min，16 ℃10 min。

2.4 Western blot檢測HDAC1-shRNA-MSCs中HDAC1蛋白表達 對各組收集的細胞進行總蛋白提取，行BCA 法蛋白含量測定，再取各樣本50 μg 蛋白行SDS-PAGE 分離、切膠、轉膜；然后5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，行相應抗體孵育雜交，應用ECL 法顯影、X 膠片顯色、暗室曝光后，掃描分析各組蛋白與β-actin的灰度比值，來代表目的蛋白的相對表達量。

Figure 1. Screening of HDAC1-shRNA-MSCs. A：MSCs at passage 3 showed adherent and spindle-shaped；B：HDAC1-shRNAMSCs were established（GFP indicated the MSCs were transfected by the lentivirus carrying HDAC1-shRNA；C：few of HDAC1-shRNA-MSCs survived when cultured with puromycin at concentration of 2 mg/L. Scale bars=100 μm.圖1 HDAC1-shRNA-MSCs穩(wěn)定細胞株的篩選

2.5 實驗分組 實驗分為4 組，主要包括MSCs 對照組（細胞不進行任何基因修飾）、HDAC1-shRNA組、vector+HDAC1-shRNA 組（將腺病毒空載體轉染至HDAC1基因沉默的MSCs 中）和Ad-HIF-1α-trip+HDAC1-shRNA 組（將Ad-HIF-1α-trip 腺病毒轉染至HDAC1基因沉默的MSCs使之過表達HIF-1α）。

2.6 Ad-HIF-1α-trip 腺 病 毒 感 染HDAC1-shRNA

MSCs 取HDAC1-shRNA-MSCs，以每孔3×105個細胞接種于6孔板中，24 h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞，加入1 mL不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h。取出Ad-HIF-1α-trip 病毒液，冰上溶解后轉染入HDAC1-shRNA-MSCs 穩(wěn)定細胞株中（MOI=100），于37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸去含腺病毒的培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.7 RT-qPCR 和Western blot 檢 測 各 組HIF-1α 和VEGF 的 表 達 RT-qPCR 和Western blot 的 方 法 同2.2和2.3，內參照亦分別為GADPH和β-actin。HIF-1α 的上游引物序列為5′-TACTGCAGCAACCAGGTGAC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-ACAGAAACGAAACCCCACAG-3′；VEGF 的上游引物序列為5′-TGTACCTCCACCATGCCAAG-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-AACAAATGCTTTCTCCGCTCTG-3′。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。計量數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 RT-qPCR檢測HDAC1-shRNA-MSCs中HDAC1的mRNA表達量

RT-qPCR 結果均采用2-ΔΔCt法算出各組模板起始拷貝數(shù)之間的相對倍數(shù)，從而得出各組間HDAC1 mRNA 表達情況的差別。RT-qPCR 結果顯示，HDAC1 mRNA 在各組樣本均有表達，其在HDAC1-shRNA-MSCs 中的表達量顯著低于正常對照和NTshRNA對照組（P＜0.01），見圖2A。

2 Western blot 檢 測HDAC1-shRNA-MSCs 中HDAC1蛋白表達量

Western blot 結果顯示，HDAC1-shRNA-MSCs 中HDAC1 蛋白表達量顯著低于正常對照和空載體對照組（P＜0.01），見圖2B。

Figure 2. HDAC1 mRNA and protein expression of HDAC1-shRNA-MSCs. RT-qPCR（A）and Western blot（B）results for HDAC1 were shown. Mean±SD. n=6.*P＜0.01 vs NT-shRNA.圖2 HDAC1基因沉默MSCs中HDAC1 mRNA及蛋白表達的檢測

3 Ad-HIF-1α-trip 腺病毒感染HDAC1-shRNAMSCs后各組HIF-1α和VEGF的表達

RT-qPCR 及Western blot 檢 測 結 果 顯 示，Ad-HIF-1α-trip 腺 病 毒 感 染HDAC1-shRNA-MSCs 后，HIF-1α 和VEGF 的mRNA 及蛋白相對表達量均顯著高于其它3組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. Detection of HIF-1α and VEGF expression. A：RT-qPCR results for HIF-1α and VEGF；B：Western blot results for HIF-1α and VEGF. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs vector+HDAC1-shRNA.圖3 各組MSCs中HIF-1α及VEGF表達量的檢測

討 論

干細胞移植療法仍然是目前治療心臟疾病的研究中最有前景的治療方法，眾多的基礎及臨床研究證明MSCs移植治療急性心肌梗死能夠改善血供，實現(xiàn)心肌重建，最后達到改善心臟功能的目的［10］。然而，干細胞的向心肌細胞定向分化的能力以及在缺血缺氧環(huán)境中的存活能力有限，大大限制了這種移植治療帶來的獲益。為了解決上述問題，學者們開始嘗試導入外源基因，提高干細胞的定向分化能力。其中，我們在前期研究中已證實組蛋白乙酰化水平與大鼠MSCs向心肌細胞分化存在著密切關系，隨著大鼠MSCs 向心肌樣細胞分化，其HDAC1基因表達量逐漸下降，而且HDAC1基因敲除可以促進MSCs向心肌樣細胞分化［3-4］。同時，也有學者證實HDAC1蛋白可以調節(jié)組蛋白乙?；綇亩绊懼杉毎翟隗w外向心肌細胞的誘導分化［2］。然而，HDAC 是通過乙?；?去乙?；h(huán)而改變了染色質的空間構型，使得染色體結構變得致密，起到基因轉錄調控的作用。在此過程中，HDAC1基因沉默不僅激活了心肌特異性基因的轉錄，同時也使HIF-1α 蛋白乙?；瘡亩黾悠浣到猓琀IF-1α 蛋白表達的下降將影響著MSCs促血管新生的作用。因此，為了解決上述問題，我們用腺病毒轉染的方法上調HIF-1α的表達。

HIF-1α 是血管新生的上游核心調控因子，能促進VEGF 等重要因子的轉錄，引起細胞對缺氧的一系列適應性反應，是血管生成的總開關基因，其表達的穩(wěn)定性取決于其結構域中有氧依賴降解區(qū)第402和564 位點上的脯氨酸羧基化程度和C 末端轉錄激活區(qū)中第803 位點上天門冬酰胺的羥化水平［11-12］。而Ad-HIF-1α-trip 通過對上述三個位點進行聯(lián)合突變，在保證HIF-1α完整性的基礎上最大程度地提高其穩(wěn)定性和轉錄活性。Li 等［9］證實，將三突變的HIF-1α基因通過腺病毒直接注射至心肌梗死周圍區(qū)域，能顯著增加缺血區(qū)域的新生血管密度，改善心功能。此外，也有研究表明，MSCs 移植后的存活率十分低下，而過表達HIF-1α可以通過調節(jié)AMPK 和mTOR 通路，有效提高MSCs 的移植后存活能力［13］。綜上所述，通過三突變HIF-1α基因可以顯著提高HIF-1α 表達量，增加VEGF 表達，對改善缺血組織血供發(fā)揮著重要作用。

在本課題組的前期研究中，HDAC1基因沉默已被證實可以促進MSCs向心肌樣細胞分化；而在本研究中，我們通過嘌呤霉素的篩選獲得了大鼠HDAC1基因沉默的MSCs 穩(wěn)定細胞株，并更進一步通過Ad-HIF-1α-trip腺病毒感染上述細胞從而獲得HDAC1基因沉默和HIF-1α過表達的MSCs，實現(xiàn)了在提高MSCs定向分化能力的同時，也成功上調了其HIF-1α的表達，增強了VEGF 的分泌能力，對MSCs 移植后促進局部血管新生、改善心臟血供更有幫助。然而，HDAC1基因沉默和HIF-1α過表達的MSCs 在體內的移植療效仍有待下一步實驗進行驗證。此外，HDAC1基因沉默和HIF-1α基因過表達的MSCs 對血管新生影響有著良好的應用前景，其機制及作用通路仍需深入探討。