劉彩虹, 楊紅輝, 盧俊娟
(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,湖南長(zhǎng)沙 410013)
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以呼吸氣流受阻為主要特征的慢性氣道炎癥性疾病,并伴有各種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道重塑,其已成為影響約6 億多人群的全球公共衛(wèi)生問題之一[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,40歲以上人群的COPD 發(fā)病率為8.2%,且隨著人口老齡化、吸煙、粉塵和感染等因素影響,其發(fā)病率和死亡率有上升趨勢(shì),預(yù)計(jì)2030 年,COPD 將成為全球第三大死亡原因[2]。臨床常用藥糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿劑、平滑肌舒張劑和抗生素等藥物雖對(duì)緩解COPD 癥狀有益,但對(duì)疾病的預(yù)后無明顯改善[3]。因此,迫切需要尋找或開發(fā)治療COPD 新的替代藥物。
山柰酚(kaempferol,Kae)是從姜科植物山柰和小檗科植物窩兒七的根莖以及豆科植物槐樹的干燥種子中提取的一種黃酮類化合物,其具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等廣泛的藥理學(xué)活性[4-5]。Molitorisova等[6]報(bào)道,山柰酚能降低卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性氣道炎癥模型豚鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BLAF)中促炎因子白細(xì)胞介素5(interleukin-5,IL-5)、IL-13、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量,并改善哮喘癥狀。但是,山柰酚在COPD 中發(fā)揮的作用及機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過構(gòu)建COPD 小鼠模型,檢測(cè)山柰酚對(duì)COPD 模型小鼠肺組織的組織形態(tài)改變、BLAF 中促炎性細(xì)胞因子含量、肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平的影響,并探討其機(jī)制。
山柰酚(純度≥98.0%)購(gòu)自Sigma;小鼠單核細(xì)胞 趨 化 蛋 白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β 和IL-5 ELISA 試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司;谷胱甘肽(glutataione,GSH)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和 超 氧 化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase,SOD)ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自武漢百皓天生物科技有限公司;BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)和Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;p-NF-κB p65(Ser536)抗體購(gòu)自沈陽萬類生物科技有限公司。
2.1 COPD 小鼠模型建立和實(shí)驗(yàn)方案 24 只6 周齡
SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠(18~20 g)購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(湘)2019-0004,飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在實(shí)驗(yàn)前,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠隨機(jī)分為4組(每組6只):對(duì)照(control)組、模型組(COPD 組)和低、高劑量山柰酚治療組(COPD+25 mg/kg Kae 組和COPD+100 mg/kg Kae 組)。對(duì)照組小鼠在正常條件下飼養(yǎng)。模型組小鼠暴露于香煙煙霧暴露環(huán)境裝置系統(tǒng)(自制煙霧暴露箱100 cm×80 cm×30 cm,一側(cè)開出煙口,另一側(cè)開小孔放置香煙,頂部設(shè)置5 cm×30 cm 觀察窗)中,COPD 小鼠造模方法根據(jù)文獻(xiàn)[7]所述:10支/日,箱中煙霧濃度控制在7%左右,暴露時(shí)間持續(xù)40 min,每間隔5 min 敲打煙箱壁1 次以避免小鼠扎堆造成吸煙量不均勻,持續(xù)12 周。低和高劑量山柰酚治療組在煙霧暴露前2 h分別灌胃25和100 mg/kg山柰酚。
2.2 BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α 含量測(cè)定 第13 周,麻醉小鼠,按照文獻(xiàn)[7]方法,用導(dǎo)管插入右肺中葉,用0.8 mL 的37 ℃PBS 灌洗3 次,每次回收量約0.5~0.6 mL,合并3 次回收的灌洗液以1 000×g離 心5 min,收集上清液。取BALF 的上清液,根據(jù)ELISA 試劑盒說明書步驟檢測(cè)BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α 的水平。待底物溶液反應(yīng)終止后,使用SynergyTMH4 Hybrid 型多功能酶標(biāo)儀(BioTek)測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度(A)值。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α的含量。
2.3 組織病理學(xué)分析 收集BALF 后,解剖并收集左肺組織,肺組織用石蠟包埋。取肺石蠟組織制作5 μm 厚的石蠟切片,根據(jù)HE 染色試劑盒說明書步驟行HE 染色。每個(gè)樣品切片任取5 個(gè)視野,根據(jù)文獻(xiàn)[8]描述方法,對(duì)間質(zhì)炎癥、肺泡壁增厚、支氣管周炎癥和間質(zhì)水腫影響的區(qū)域,進(jìn)行肺組織損傷評(píng)分。
2.4 肺組織中GSH、NO、MDA和SOD水平測(cè)定 取肺組織在冰上勻漿,用BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定勻漿液中的蛋白濃度,然后根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測(cè)勻漿液中GSH、NO、MDA 和SOD 的含量。然后根據(jù)勻漿液中的蛋白濃度,將勻漿液中GSH、NO、MDA 和SOD 的含量標(biāo)準(zhǔn)化為肺組織中GSH、NO、MDA和SOD的水平。
2.5 免疫熒光 取肺組織,脫蠟至水后,在0.2%Triton X-100 中透化,用10%山羊血清封閉30 min,然后用1∶100稀釋的抗p-NF-κB p65抗體4 ℃孵育過夜;PBS洗滌后,用1∶100稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)避光室溫溫育1 h,用DAPI 染核15 min,熒光顯微鏡下觀察。
2.6 Western blot 取肺組織,用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白,用蛋白含量檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白定量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE 后,將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,PVDF膜經(jīng)封閉后,室溫分別孵育抗p-NF-κB p65 抗體(1∶1 000稀釋)1.5 h,TBST洗膜3次后,室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)(1∶2 000 稀釋)45 min,TBST 洗膜3 次后,利用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)目的條帶顯影,以GAPDH 為內(nèi)參照,采用Image-Pro Plus軟件測(cè)量目的條帶的光密度。
采用GraphPad Prism 6 軟件將實(shí)驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組之間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
HE 染色顯示,對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常,肺泡間隔規(guī)則有序;COPD 模型組小鼠肺泡壁增厚,肺泡間隔不規(guī)則甚至不可辨認(rèn),在病變的肺泡周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和出血點(diǎn),支氣管腔壁增厚,在病變支氣管周可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)且支氣管腔內(nèi)黏液填充或閉塞;低劑量山柰酚治療組小鼠肺組織改變相對(duì)模型組有所改善,肺組織形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為:部分肺泡壁增厚和肺泡間隔不規(guī)則,病變的肺泡周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和小量出血點(diǎn),在病變支氣管周可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)且支氣管腔內(nèi)黏液分泌較多;高劑量山柰酚治療組絕大多數(shù)肺泡結(jié)構(gòu)趨向正常,肺泡間隔趨向規(guī)則,在少量肺泡壁增厚的肺間質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),見圖1A。肺組織損傷評(píng)分結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,COPD 模型組小鼠肺組織損傷評(píng)分顯著升高(P<0.01);與模型組比較,低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織損傷評(píng)分均顯著降低,且以高劑量山柰酚治療組最為顯著(P<0.01),見圖1B。
Figure 1. Effect of kaempferol(Kae)on histomorphological changes of lung tissues in COPD mice(HE staining,scale bar=50 μm).Mean±SD. n=6.##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs COPD group.圖1 山柰酚對(duì)COPD小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響
ELISA 結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,COPD 模型組小鼠BALF 中促炎癥因子IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNFα 水平均顯著升高(P<0.01);與COPD 模型組比較,低和高劑量山柰酚治療組小鼠BALF 中上述促炎癥因子水平均顯著降低(P<0.05),且以高劑量山柰酚治療組降低最為顯著(P<0.01),見圖2。
Figure 2. Effect of kaempferol(Kae)on the levels of pro-inflammatory factors in BLAF of COPD mice. IL-1β(A),IL-5(B),MCP-1(C)and TNF-α(D)levels in BLAF of mice in each group. Mean±SD. n=6.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs COPD group.圖2 山柰酚對(duì)COPD小鼠BLAF中促炎癥因子水平的影響
與對(duì)照組比較,COPD 模型組小鼠肺組織中MDA 和NO 水平均顯著升高(P<0.01),SOD 和GSH水平顯著降低(P<0.01);與COPD 模型組比較,低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織中MDA 和NO 水平均顯著降低(P<0.01),SOD 和GSH 水平則顯著升高(P<0.01),且以高劑量山柰酚治療組變化最為顯著(P<0.01),見圖3。
Figure 3. Effect of kaempferol(Kae)on the levels of oxidative stress markers in lung tissue of COPD mice. MDA(A),SOD(B),GSH(C)and NO(D)levels in lung tissues of mice in each group. Mean±SD. n=6.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs COPD group.圖3 山柰酚對(duì)COPD小鼠肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平的影響
免疫熒光結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肺組織中可見極少量p-NF-κB p65 陽性細(xì)胞;COPD 模型組小鼠肺組織中可見大量p-NF-κB p65陽性細(xì)胞;低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織中p-NF-κB p65 陽性細(xì)胞數(shù)較COPD 模型組有所降低,以高劑量山柰酚治療組尤為明顯,見圖4A。Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,COPD 模型組小鼠肺組織中p-NF-κB p65蛋白水平顯著增加(P<0.01);與COPD 模型組比較,低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織中p-NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低(P<0.01),且以高劑量山柰酚治療組最為顯著(P<0.01),見圖4B。
Figure 4. Effect of kaempferol(Kae)on the activation of NF-κB in lung tissue of COPD mice. A:representative images of immunofluorescence of p-NF-κB p65(scale bar=100 μm);B:Western blot assay of p-NF-κB p65 protein. Mean±SD. n=6.##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs COPD group.圖4 山柰酚對(duì)COPD小鼠肺組織NF-κB活化的影響
COPD 的主要危險(xiǎn)因素為長(zhǎng)期吸煙。香煙煙霧中含有如一氧化碳、尼古丁、苯酚和醛等大量有害物質(zhì),這些物質(zhì)可導(dǎo)致氣道以及肺實(shí)質(zhì)中炎癥因子生成以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),從而引起炎癥損傷以及氣道重塑和小氣道阻塞,造成肺功能障礙[9-10]。抑制氣道和肺實(shí)質(zhì)中炎癥反應(yīng)能減輕COPD 癥狀和氣道重塑[11]。山柰酚已被證明在哮喘、急性氣管炎和急性肺損傷等多種模型中具有抑制氣道和肺實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng) 以 及 抑 制 黏 液 蛋 白 合 成 的 作 用[6,12-16],而 其 對(duì)COPD 模型小鼠的影響并不清楚。本研究結(jié)果顯示,山柰酚不僅能改善香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD 模型小鼠肺組織形態(tài)表現(xiàn),還能顯著降低COPD 小鼠BALF 中促炎性因子MCP-1、TNF-α、IL-1β 和IL-5 水平。NFκB 是最重要的炎癥信號(hào)之一,文獻(xiàn)[17-18]證實(shí),NF-κB途徑的激活與COPD 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),長(zhǎng)期香煙煙霧暴露能使肺組織中NF-κB 激活,而NF-κB活性過度激活能進(jìn)一步促進(jìn)肺組織中炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和氣道重塑,進(jìn)而加重COPD 癥狀。且已有報(bào)道[14-16]顯示,山柰酚可通過抑制NF-κB 活性來降低LPS 和H9N2 豬流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷。本研究結(jié)果也顯示,經(jīng)山柰酚治療后,COPD 小鼠肺組織中p-NFκB p65蛋白水平明顯降低,提示山柰酚能降低COPD小鼠肺組織中NF-κB信號(hào)活化水平。
氧化應(yīng)激不僅是COPD 發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)主要的誘發(fā)因素,也是促進(jìn)COPD 進(jìn)展的重要驅(qū)動(dòng)因素之一[19]。香煙煙霧中的外源性氧化劑以及吸煙導(dǎo)致的肺部炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞生成的內(nèi)源性活性氧,可以破壞機(jī)體的抗氧化劑/氧化劑平衡,導(dǎo)致COPD患者的肺部氧化應(yīng)激增加[19-20]。氧化應(yīng)激能放大肺部和氣道的慢性炎癥,并能直接損害肺組織,誘導(dǎo)肺氣腫形成,從而導(dǎo)致氣流阻塞[9,20]。研究表明[9,20-21],抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)能減輕COPD 癥狀并能阻止氣道重塑。本研究結(jié)果顯示,山柰酚能降低COPD 模型小鼠肺組織中MDA 和NO 水平,并能升高SOD 和GSH 水平,提示山柰酚能在一定程度上修復(fù)COPD模型小鼠肺組織中抗氧化劑/氧化劑失衡,降低肺組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)。
綜上所述,山柰酚對(duì)小鼠COPD 能發(fā)揮治療作用,且這一作用可能與其抗炎、抗氧化和抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。