朱 麗， 周敬群△， 吳 鋼， 王 順， 毛 帥

（1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院，湖北宜昌 443001；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢 430060）

心臟肥大是心臟為適應(yīng)高血壓、主動(dòng)脈瓣狹窄和心肌梗死等各種病理?xiàng)l件而增強(qiáng)心輸出量的代償過程，其特征是單個(gè)心肌細(xì)胞和整個(gè)器官的體積增大。最初，心臟肥大是一種保護(hù)心臟的代償機(jī)制。然而，持續(xù)和過度應(yīng)激誘發(fā)的病理性心肌肥大是不利的，可能最終導(dǎo)致心力衰竭、猝死和中風(fēng)［1-2］。

肌球蛋白輕鏈2（myosin light chain 2，MLC2）是肌球蛋白的重要組成部分，其N 端有絲氨酸殘基，可被肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）以Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴/不依賴的方式特異性地磷酸化［3-6］。MLC2 的磷酸化在調(diào)控心肌收縮中發(fā)揮重要作用。近期通過對(duì)轉(zhuǎn)基因、基因敲除和基因突變小鼠模型的研究表明，MLCK 和p-MLC2 在調(diào)節(jié)心臟肥大方面也至關(guān)重要。過表達(dá)MLCK 可以減輕壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大，而敲除MLCK基因具有相反的作用，同時(shí)，MLC2 的磷酸化位點(diǎn)發(fā)生突變亦能加重壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心臟肥大［7-9］。另有研究表明，血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）、苯腎上腺素和內(nèi)皮素急性刺激心肌細(xì)胞和大鼠心臟均可導(dǎo)致MLCK、p-MLC2 和隨后的肌節(jié)組織重組增加，而MLCK 抑制劑可阻止上述改變［10］。這些結(jié)果均提示MLCK 和磷酸化MLC2 可能成為干預(yù)心臟肥大發(fā)生和發(fā)展的重要靶點(diǎn)。

基于上述證據(jù)，本研究分別通過Ang II 刺激和腹主動(dòng)脈縮窄（aorta banding，AB）建立心肌細(xì)胞肥大和大鼠壓力超負(fù)荷心臟肥大模型，并通過抑制MLCK 來探討干預(yù)MLCK 及p-MLC2 對(duì)心臟肥大的影響。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

抗MLCK 和GAPDH 抗體（Abcam）；抗MLC2、p-MLC2 和α-actinin 抗體（Cell Signaling Technology）；MLCK 抑制劑ML-7（Santa Cruz Biotechnology）；Trizol購自Invitrogen；cDNA 合成試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix 購自Roche；RIPA 裂解液購自碧云天；BCA 蛋白定量試劑盒購自普利萊；PVDF 膜購自Millipore。心臟超聲采用Vevo 2100 System（Visual-Sonics）；顯微鏡購自O(shè)lympus；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照美國國立衛(wèi)生研究院出版的第8版《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》（Guide NRC，2011）進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0027］，包括1～3 d 的SD乳鼠和6 周齡的SD 大鼠。6 周齡雄性SD 大鼠體重180～220 g，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件為溫度20～25 ℃、濕度40%～70%和光照12/12 h光/暗周期。

3 方法

3.1 動(dòng)物造模與MLCK 抑制劑處理 將60 只大鼠隨機(jī)分為6組：（1）AB 0周組；（2）AB 2周組；（3）AB 4周組；（4）假手術(shù)組（sham 組）；（5）AB 組；（6）AB+MLCK 抑制劑ML-7 組（AB+ML-7 組）。大鼠AB 手術(shù)誘導(dǎo)壓力超負(fù)荷心臟肥大的過程簡述如下［11-13］：首先，經(jīng)腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，褪去腹部鼠毛；然后，仰臥位固定大鼠，依次沿腹中線剪開皮膚、肌肉和腹膜，撥開腸道后分離腹主動(dòng)脈，在腎上腺水平以7-0 絲線將22G 的鈍性針頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，閉塞腹主動(dòng)脈，后迅速拔除針頭，導(dǎo)致腹主動(dòng)脈腔部分狹窄。對(duì)照組大鼠除未進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄外，其余操作均相同。術(shù)后進(jìn)行超聲多普勒檢測，以確定AB 手術(shù)是否成功。術(shù)后第1 天開始通過腹腔注射ML-7（1 mg/kg，溶于生理鹽水，每天1次）對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)［14］，另外兩組大鼠通過腹腔注射接受相同體積的生理鹽水，持續(xù)4周。

3.2 心臟超聲檢測與取材 如前所述，大鼠AB 術(shù)后4 周，通過超聲心動(dòng)圖評(píng)估心臟功能［11-13］。首先，大鼠在仰臥位下以1.5～2%異氟烷進(jìn)行吸入性維持麻醉。然后，采用Vevo 2100 System 經(jīng)大鼠胸骨旁采集心臟短軸二尖瓣乳頭肌切面的M 型超聲心動(dòng)圖。根據(jù)美國超聲心動(dòng)圖學(xué)會(huì)指南，測量至少3 個(gè)心動(dòng)周期的左室收縮/舒張末期室間隔厚度（left ventricular end-systolic/diastolic interventricular septum thickness，IVSs/IVSd）、左室收縮/舒張末期后壁厚度（left ventricular end-systolic/diastolic posterior wall thickness，LVPWs/LVPWd）和左室收縮/舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic/diastolic internal diameter，LVIDs/LVIDd），再取其平均值。計(jì)算左室收縮/舒張末期容積（left ventricular end-systolic/diastolic volume，LVESV/LVEDV）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）［12-13］。

超聲心動(dòng)圖完成后，立即稱重并處死大鼠，以獲取心臟、肺和脛骨。先將心臟浸入1 mol/L 氯化鉀溶液中，使其停跳于舒張狀態(tài)。然后，在0.9%生理鹽水中清洗心臟、肺和脛骨，分別測量心臟和肺的重量以及脛骨的長度。然后，取部分心臟組織浸沒于4%多聚甲醛中室溫固定，其余心臟組織立即經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于RNA和蛋白提取。

另外，前3 組大鼠分別于AB 手術(shù)后0 周、2 周和4周取材，方法與上述一樣。

3.3 病理學(xué)檢測 心臟組織在4%多聚甲醛中室溫固定24 h 后，采用石蠟包埋。將心臟組織切成5 μm的切片，隨后分別進(jìn)行HE 和Masson 染色并在顯微鏡下采集相應(yīng)的圖像。使用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics Inc.）對(duì)HE 和Masson 染色進(jìn)行分析，分別用于測量心肌細(xì)胞的橫截面積（cross-sectional area）和心肌纖維化程度。每組取不少于100 個(gè)心肌細(xì)胞計(jì)算心肌細(xì)胞的橫截面積。每組至少測量50個(gè)左室間質(zhì)和血管周圍區(qū)域的視野，以確定心肌纖維化的程度。

3.4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)和MLCK 抑制劑處理 原代乳鼠心肌細(xì)胞（neonatal rat cardiomyocytes，NRCMs）分離及培養(yǎng)的方法如前所述［12-13］。1～3 日齡的SD 乳鼠麻醉處死后迅速乙醇消毒胸部皮膚，剪開胸壁取出心臟置于PBS 中，洗凈血液后修剪保留心室，剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm 的組織小塊。隨后加入含0.08% II 型膠原酶和0.125%胰蛋白酶的消化液，37 ℃下消化每次10 min，第1 次棄上清，之后均收集上清，此過程持續(xù)至心臟組織被完全消化。隨后通過差速貼壁的方法將心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞分離，并以含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素和0.1 mmo/L BrdU 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)液換成1%的FBS。24 h 后，將心肌細(xì)胞隨機(jī)分至3 個(gè)處理組：（1）PBS 組；（2）1 μmol/L Ang II組；（3）1 μmol/L Ang II+1 μmol/L ML-7組。處理48 h后收細(xì)胞［13，15］。細(xì)胞經(jīng)免疫熒光雙染（α-actinin 和cardiac troponin T）證實(shí)心肌細(xì)胞的純度大于95%。

3.5 免疫熒光染色 心肌細(xì)胞免疫熒光染色的方法如前所述［11-13］。用于免疫熒光染色的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有蓋玻片的6孔板中，處理結(jié)束之后用PBS洗凈，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，后以0.5% Triton X-100 室溫下通透10 min，山羊血清室溫下封閉30 min，隨后與α-actinin 抗體（1∶100）4 ℃下孵育過夜。第2天與相應(yīng)的Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。隨后室溫下DAPI 染色10 min。然后在熒光顯微鏡下采集心肌細(xì)胞熒光染色圖片。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量心肌細(xì)胞表面積。每組測量超過100 個(gè)心肌細(xì)胞用以計(jì)算其表面積。

3.6 RT-qPCR 如前所述［12-13］，根據(jù)制造商的說明，使用Trizol 從心肌細(xì)胞和冷凍大鼠心臟組織中提取總RNA，然后利用cDNA 合成試劑盒合成cDNA。然后，采用SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行熒光定量PCR，將內(nèi)源性GAPDH 的mRNA 含量設(shè)為對(duì)照，量化目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。用于擴(kuò)增的心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）正向引物序列為5′-ATACAGTGCGGTGTCCAACA-3′，反 向 引 物 序 列為5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCA-3′；腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）的 正 向 引 物 序 列 為5′-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3′，反向引物序列為5′-GCAGCTTGAACTATGTGCCA-3′；β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的正向引物序列為5′-GCTCCTAAGTAATCTGTTTG-3′，反向引物序列為5′-AAGTGAGGGTGCGTGGAGCG-3′；GAPDH 的的正向引物序列為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反 向 引 物 序 列 為5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。

3.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)［12-13，16-17］用RIPA 裂解液從心肌細(xì)胞和冷凍大鼠心臟組織中提取蛋白質(zhì)，形成蛋白溶液。使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE 對(duì)每個(gè)樣品中等量的蛋白質(zhì)（20 μg）進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉這些膜1 h后，將這些膜與以下相對(duì)應(yīng)的Ⅰ抗在4 ℃下孵育過夜：MLCK（1∶1 000）、p-MLC2（1∶1 000）、MLC2（1∶500）和GAPDH（1∶2 000）。然后，在室溫下與Ⅰ抗相應(yīng)的辣根過氧化物酶結(jié)合Ⅱ抗孵育1 h。后使用化學(xué)發(fā)光顯影液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯示目標(biāo)條帶，并將目標(biāo)條帶用ImageJ（National Institutes of Health）進(jìn)行量化分析。以每個(gè)樣本中的GAPDH 蛋白含量作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到每個(gè)樣本中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制MLCK減輕Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

在Ang II 刺激48 h 后，心肌細(xì)胞中ANP、BNP 和β-MHC 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)心肌細(xì)胞表面積也顯著增大；與單純Ang II 刺激相比，給予MLCK 抑制劑同時(shí)處理后，心肌細(xì)胞中ANP、BNP和β-MHC 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)心肌細(xì)胞表面積也顯著減小，見圖1。這些結(jié)果表明抑制MLCK可減輕Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

Figure 1. Immunofluorescence staining of primary neonatal rat cardiomyocytes and relative mRNA expression levels of cardiac hypertrophy markers. A：representative images of cardiomyocyte immunofluorescence staining and the quantitative analysis of cardiomyocyte surface area；B，C and D：the relative mRNA expression levels of cardiomyocyte hypertrophy markers，ANP，BNP and β-MHC. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBS group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ang II group.圖1 原代乳鼠心肌細(xì)胞免疫熒光染色和心臟肥大標(biāo)志物的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

2 抑制MLCK 減輕Ang II 誘導(dǎo)的MLC2 磷酸化水平升高

Ang II 處理心肌細(xì)胞48 h 后，MLCK 的表達(dá)水平和MLC2 的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）；與Ang II 處理相比，MLCK 抑制劑處理后心肌細(xì)胞中MLCK 的表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯的變化，但MLC2 的磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），見圖2。這些結(jié)果表明抑制MLCK 可減輕Ang II 誘導(dǎo)的MLC2 磷酸化水平升高。

Figure 2. The protein levels of MLCK and phosphorylated MLC2 in cardiomyocytes after Ang II and MLCK inhibitor treatment for 48 h. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBS group；##P＜0.01 vs Ang II group.圖2 Ang II和MLCK抑制劑處理48 h后心肌細(xì)胞MLCK和磷酸化MLC2蛋白水平的變化

3 MLCK 和磷酸化MLC2 蛋白水平在心臟肥大中先升高后降低

收集大鼠AB術(shù)后0周、2周和4周的心臟組織用于提取RNA 和蛋白，分別檢測心臟肥大過程中肥大標(biāo)志物的mRNA 表達(dá)水平以及MLCK 和磷酸化MLC2 的蛋白水平。隨著大鼠AB 時(shí)間的延長，心臟肥大標(biāo)志物ANP、BNP 和β-MHC 的相對(duì)mRNA 表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3A。與0周組相比，AB 術(shù)后2 周大鼠心臟組織中MLCK 和磷酸化MLC2的蛋白水平顯著升高，而AB術(shù)后4周MLCK和磷酸化MLC2 的蛋白水平顯著下降，甚至低于0 周組，見圖3B。這些結(jié)果表明在大鼠壓力超負(fù)荷心臟肥大的過程中，MLCK 和磷酸化MLC2 的蛋白水平先升高后降低。

Figure 3. Relative levels of cardiac hypertrophy marker mRNA expression，MLCK protein expression and MLC2 phosphorylation after aorta banding for different time in rat heart tissues. A：the relative mRNA expression levels of cardiac hypertrophy markers ANP，BNP and β-MHC in rat heart tissues；B：the images of Western blot for determining the protein levels of MLCK，p-MLC2，MLC2 and GAPDH in rat heart tissues after aorta banding for 0，2 and 4 weeks，and the quantitative statistical results. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 week；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 2 weeks.圖3 大鼠腹主動(dòng)脈縮窄不同時(shí)間后心臟肥大標(biāo)志物mRNA表達(dá)、MLCK蛋白表達(dá)和MLC2磷酸化水平的比較

4 抑制MLCK改善壓力超負(fù)荷大鼠的心功能

AB 術(shù) 后4 周，AB 組 大 鼠 的LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV均顯著增加，而LVEF和LVFS顯著降低，表明AB 組大鼠已出現(xiàn)明顯的心功能不全并伴有嚴(yán)重的左室擴(kuò)張；與AB 組相比，AB+ML-7 組大鼠的這些超聲心動(dòng)圖參數(shù)有明顯改善的趨勢(shì)；sham 組和AB 組IVSd、IVSs、LVPWd和LVPWs的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但AB+ML-7組的上述值均顯著大于AB組，見圖4A、表1。這些結(jié)果表明抑制MLCK 改善了壓力超負(fù)荷大鼠的心功能。

表1 大鼠腹主動(dòng)脈縮窄及抑制MLCK 4周后的超聲心動(dòng)圖結(jié)果Table 1. The results of echocardiography after 4 weeks of aorta banding and MLCK inhibition in rats（Mean±SD.n=10）

5 抑制MLCK減輕壓力超負(fù)荷大鼠的心重指數(shù)

與sham 組相比，AB 組的心重/體重（heart weight/body weight，HW/BW）、心重/脛骨長（heart weight/tibia length，HW/TL）、肺重/體重（lung weight/body weight，LW/BW）和肺重/脛骨長（lung weight/tibia length，LW/TL）均顯著增加；而AB+ML-7 組的這些指標(biāo)均顯著低于AB 組，見圖4B～E。這些結(jié)果表明抑制MLCK減輕了AB導(dǎo)致的心重指數(shù)升高。

Figure 4. Echocardiography，heart weight（HW）indexes and lung weight（LW）indexese of the rats after aorta banding（AB）and MLCK inhibitor treatment for 4 weeks. A：the representative echocardiogram images in the rats after AB for 4 weeks；B and C：the HW to body weight（BW）ratio and HW to tibial length（TL）ratio of the rats；D and E：the LW to BW ratio and LW to TL ratio of the rats. Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs AB group.圖4 大鼠腹主動(dòng)脈縮窄及抑制MLCK 4周后的超聲心動(dòng)圖及心重和肺重指數(shù)的比較

6 抑制MLCK 減輕壓力超負(fù)荷大鼠心臟組織病理學(xué)改變

心臟組織HE 和Masson 染色分別用于分析心肌細(xì)胞肥大和纖維化的程度。AB 組心肌細(xì)胞橫截面積和纖維化比例均顯著大于sham 組；與AB 組相比，AB+ML-7組心肌細(xì)胞的橫截面積和纖維化比例顯著降低，見圖5A。這些結(jié)果表明抑制MLCK 改善了AB導(dǎo)致的心臟組織病理學(xué)改變。

7 抑制MLCK 降低壓力超負(fù)荷大鼠心臟肥大標(biāo)志物的表達(dá)

與sham 組相比，AB 組大鼠心臟肥大標(biāo)志物ANP、BNP 和β-MHC 的相對(duì)mRNA 表達(dá)水平均顯著升高，而這些標(biāo)志物在AB+ML-7 組大鼠中均顯著下降，見圖5B～D。這些結(jié)果表明抑制MLCK減輕了AB導(dǎo)致的心臟肥大標(biāo)志物表達(dá)升高。

Figure 5. HE and Masson staining and relative expression of hypertrophy markers in rat heart tissues. A：the representative images of HE and Masson staining，and the quantitative statistical results of cardiomyocyte cross-sectional area and fibrosis area（scale bar=50 μm）；B，C and D：the relative mRNA expression levels of cardiac hypertrophy markers ANP，BNP and β-MHC in rat heart tissues. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs AB group.圖5 大鼠心肌組織的HE和Masson染色以及肥厚標(biāo)志物相對(duì)表達(dá)水平的比較

8 抑制MLCK 降低MLC2 的磷酸化水平而不影響MLCK表達(dá)

大鼠AB 術(shù)后4 周的心臟組織被用于檢測MLCK表達(dá)和MLC2 磷酸化的水平。與sham 組相比，AB 組大鼠心臟組織中的MLCK 表達(dá)和MLC2 磷酸化水平顯著降低；AB+ML-7 組大鼠的MLCK 表達(dá)水平出現(xiàn)了類似AB 組的下降，而MLC2 磷酸化水平顯著低于AB 組，見圖6。這些結(jié)果表明抑制MLCK 并不影響MLCK的表達(dá)，但影響MLC2的磷酸化。

Figure 6. The protein levels of MLCK and phosphorylated MLC2 in rat heart tissues after aorta banding and MLCK inhibition for 4 weeks were detected by Western blot. Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs AB group.圖6 大鼠腹主動(dòng)脈縮窄及抑制MLCK 4周后心肌組織MLCK表達(dá)和MLC2磷酸化水平的比較

討 論

MLC2是肌球蛋白的重要組成部分，可被其特異性的激酶MLCK 以Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴/不依賴的方式激 活 而 發(fā) 生 磷 酸 化，生 成p-MLC2［4-6］。MLCK 和p-MLC2在調(diào)節(jié)心肌收縮、功能和疾病方面發(fā)揮直接且重要的作用［18-20］。盡管如此，目前并不清楚特異性地抑制MLCK 能否影響心臟肥大的病理進(jìn)程。在本研究中，我們分別建立了Ang II 刺激產(chǎn)生的心肌細(xì)胞肥大和壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大模型，并采用抑制劑對(duì)MLCK 進(jìn)行特異性地抑制，結(jié)果表明：（1）抑制MLCK 可減輕Ang II 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；（2）抑制MLCK 可減輕Ang II 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MLC2的磷酸化水平升高；（3）MLCK 表達(dá)和MLC2 磷酸化水平在大鼠心臟肥大中先升高后降低；（4）抑制MLCK 改善壓力超負(fù)荷大鼠的心功能、心重指數(shù)、心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化和心臟肥大標(biāo)志物；（5）抑制MLCK 降低壓力超負(fù)荷大鼠的MLC2磷酸化水平而不影響MLCK表達(dá)。

本研究通過Ang II 刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，并檢測心肌細(xì)胞表面積和肥大標(biāo)志物以確定心肌細(xì)胞肥大模型成功建立。與PBS組相比，Ang II處理后心肌細(xì)胞表面積明顯增大，且肥大標(biāo)志物表達(dá)顯著升高，而抑制MLCK 后上述改變明顯減輕。另外，Ang II 處理后心肌細(xì)胞的MLCK 和p-MLC2 均明顯升高，抑制MLCK 可減輕MLC2 的磷酸化而不影響MLCK的表達(dá)。上述結(jié)果證實(shí)MLCK 抑制劑ML-7 通過抑制MLCK 的催化功能進(jìn)而發(fā)揮作用。同時(shí)早期的研究也表明，心臟肥大的激動(dòng)劑包括Ang II、苯腎上腺素和內(nèi)皮素急性刺激培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和大鼠心臟可導(dǎo)致MLCK、p-MLC2和隨后的肌節(jié)組織重組增加，而上述肥大刺激引起的肌節(jié)組織重組可被MLCK 的抑制劑阻止［10］。上述證據(jù)表明MLCK 和p-MLC2 參與并促進(jìn)了心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生。

超聲心動(dòng)圖、組織病理學(xué)和RT-qPCR 的結(jié)果證實(shí)AB 手術(shù)可成功誘導(dǎo)大鼠心臟肥大。與sham 組相比，AB 引起LVEDD、LVESD、LVEDV 和LVESV 明顯增加，同時(shí)LVEF 和LVFS 明顯下降，而IVSd、IVSs、LVPWd和LVPWs沒有明顯的變化，這些結(jié)果提示大鼠已出現(xiàn)離心性和失代償性心臟肥大；抑制MLCK后上述超聲指標(biāo)均得到改善，而IVSd、IVSs、LVPWd和LVPWs 均較AB 組增大，提示AB+ML-7 組大鼠仍處于向心性肥大向離心性肥大轉(zhuǎn)變的階段。

近期基于轉(zhuǎn)基因、基因敲除和基因突變小鼠模型的研究普遍認(rèn)為MLCK 和p-MLC2 在改善心臟肥大和心力衰竭的病理進(jìn)程中發(fā)揮積極作用［7-9，21-23］，而本項(xiàng)研究卻通過抑制MLCK 使壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大得到改善。之前的研究表明MLCK 和p-MLC2 在心臟肥大和心力衰竭中發(fā)生降低［9，24］，但并未檢測心臟肥大過程中MLCK 和p-MLC2 隨時(shí)間的變化。本研究首次對(duì)心臟肥大過程中MLCK 和p-MLC2 隨時(shí)間的變化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示MLCK 和p-MLC2 在心臟肥大的早期升高，而在晚期降低。此外，4 周的游泳訓(xùn)練可增加野生型小鼠MLCK 和p-MLC2 的水平［9］。MLCK 和MLC2 磷酸化位點(diǎn)突變的小鼠在應(yīng)對(duì)壓力超負(fù)荷時(shí)表現(xiàn)出離心性心臟肥大，而非在野生型小鼠上觀察到的典型向心性心臟肥大［8］。同時(shí)，胸主動(dòng)脈縮窄1 周后可導(dǎo)致MLCK 和p-MLC2水平明顯降低，緊隨其后是代償性心臟肥大發(fā)展為失代償性心臟肥大［9］，這些結(jié)果均提示MLCK 和p-MLC2 在心臟適應(yīng)應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，在應(yīng)對(duì)壓力超負(fù)荷的早期甚至出現(xiàn)升高。而本研究也已證實(shí)MLCK 和p-MLC2 在壓力超負(fù)荷心臟肥大的早期水平升高。而抑制MLCK 可改善壓力超負(fù)荷引起的心臟肥大，可能與抑制心臟肥大早期MLCK 和p-MLC2的升高和功能，進(jìn)而減輕心肌肌節(jié)重組和心肌重構(gòu)相關(guān)。早期的研究也證實(shí)，即使在非病理狀態(tài)下，過表達(dá)MLCK 也能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的肌節(jié)重組，而敲低MLCK僅能夠輕微地減輕心肌細(xì)胞的肌節(jié)重組［5］。值得注意的是，MLCK敲除或MLC2 磷酸化位點(diǎn)突變的小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)下可自發(fā)出現(xiàn)心臟肥大，這一方面可能與基因敲除或突變影響了正常小鼠心臟的發(fā)育或生長有關(guān)；另一方面可能與正常的MLC2磷酸化平衡狀態(tài)被打破，進(jìn)而引起心肌異常做功有關(guān)［8-9］。另外，在壓力超負(fù)荷心臟肥大的早期，抑制MLCK 改善心臟肥大的病理進(jìn)程可能還涉及通過抑制MLCK磷酸化MLC2過程，進(jìn)而發(fā)揮減少心肌收縮做功和降低心肌氧耗的作用。

本研究首次證明抑制MLCK 可改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大，此作用可能涉及抑制MLCK功能及MLC2 磷酸化進(jìn)而阻止心臟肥大早期肌節(jié)組織的重構(gòu)。該發(fā)現(xiàn)為病理性心臟肥大的防治提供了新見解。