唐文誠何 清宋大萍沈政洪王繼生*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.綿陽市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000)

藥物引起的肝損傷是急性肝衰竭的主要原因，這是由于人體中累積的藥物代謝為有毒物質(zhì)，并有助于產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，炎癥和細(xì)胞凋亡，從而誘發(fā)肝細(xì)胞壞死最終損害肝[1]。盡管藥物性肝損傷臨床發(fā)病率相對較低，但在發(fā)達(dá)國家，它仍然是急性肝衰竭的常見原因[2]。對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)是世界上最受歡迎和最安全的止痛藥之一，然而由于其廣泛的可用性，它經(jīng)常涉及有意或無意的過量使用，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，目前廣泛用于臨床建立藥物性肝損傷動物模型[3－4]。

近年來的研究表明，由于中草藥具有治療作用，被認(rèn)為是改善肝和其他疾病的潛在藥物[5]。敗醬草(herba patriniae)是多年生中草藥，含有氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生物堿等有益成分，具有抗氧化、抗菌、消除血瘀，促進肝細(xì)胞再生和減輕焦慮的作用[6]。已有研究表明白花敗醬草醇提物通過抗氧化及抑制肝細(xì)胞凋亡而改善四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[7]，說明敗醬草的肝保護作用。但敗醬草對藥物性肝損傷的具體作用機制尚未見報道，本文旨在探究敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的大鼠藥物性肝損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只SD清潔級大鼠，雄性，12周齡，體重280±10 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]，動物合格證編號:11400700183999，常規(guī)飼喂。所有大鼠均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)SPF動物房[SYXK(川)2018-065]。本研究經(jīng)綿陽市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC-2020D127-21)，實驗設(shè)計及實施過程中嚴(yán)格遵循動物實驗的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

敗醬草(121271-201201)、對乙酰氨基酚(100018-201610)購自中國食品藥品檢定研究院；聯(lián)苯雙酯(T3273)購自美國Target Molecule Corp公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(C0105M)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H＋L)(A0208)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)測試盒(C009-2-1)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)測試盒(C010-2-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒(A059-1-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(A003-1-2)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒(A005-1-2)購自南京建成生物工程研究所；TNF-α(JK-(a)-0016)、IL-6(JK-(a)-1498)、IL-1β(JK-(a)-E06517)ELISA測試盒購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組

將大鼠隨機分為6組:對照組、模型組、敗醬草低劑量組、敗醬草中劑量組、敗醬草高劑量組、聯(lián)苯雙脂組，每組10只。除對照組外，其余各組參照王茜等[8]方法每日灌胃對乙酰氨基酚1000 mg/kg，每日1次，連續(xù)30 d復(fù)制肝損傷模型。造模同時，敗醬草低劑量組、敗醬草中劑量組和敗醬草高劑量組每日灌胃敗醬草4、8、16 g/kg[9]，聯(lián)苯雙脂組每日灌胃聯(lián)苯雙脂0.3 g/kg[10]，對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)30 d。

1.3.2 肝臟指數(shù)

最后1次灌胃12 h后，測量各組大鼠重，處死所有大鼠，測量體重，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)＝肝重量(g)/體重(g)×100%。

1.3.3 HE染色

將各組大鼠肝組織于4%多聚甲醛中固定72 h，隨后對已固定的肝組織置于20%乙二胺四乙酸中進行脫鈣處理，將樣品在梯度濃度的乙醇中脫水并包埋在石蠟中。將石蠟包埋的組織切成5 mm切片，于室溫下進行蘇木精染色10 min，伊紅染色2 min。使用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.3.4 血清生化指標(biāo)

按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定血清中ALT、AST和ALP水平。ALT、AST在510 nm處測OD值，AKP在520 nm處測OD值。

1.3.5 ELISA

取各組大鼠肝組織，滴入含有蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，制作成勻漿液，離心收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書測定肝組織上清液TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

1.3.6 氧化應(yīng)激

按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定肝組織勻漿中SOD含量，采用可見分光光度計測定丙二醛MDA、GSH-Px含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗或單因素方差分析進行檢驗。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 敗醬草降低對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)

與對照組相比較，模型組肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s，n＝10)Table 1 Effect of herba patriniae on hepatic index in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表1 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s，n＝10)Table 1 Effect of herba patriniae on hepatic index in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose肝臟指數(shù)(%)Liver index對照組Control gourp 0 2.8±0.4模型組Model group 0 4.5±0.9*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 3.2±0.2＃敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 3.3±0.3＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 3.1±0.3＃聯(lián)苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 3.2±0.3＃

2.2 敗醬草改善對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠肝組織病理損傷

對照組肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。模型組細(xì)胞排列紊亂，有明顯出血，大量炎性細(xì)胞浸潤。敗醬草中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組細(xì)胞排列較整齊，出血明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

圖1 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠肝組織病理損傷的影響Figure 1 Effect of herba patriniae on pathological injury of rat liver tissue induced by paracetamol-induced drug-induced liver injury

2.3 敗醬草降低對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平

與對照組相比較，模型組AST、ALT、ALP水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草低、中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組AST、ALT、ALP水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平的影響(±s，n＝10)Table 2 Effects of herba patriniae on AST，ALT and ALP levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表2 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平的影響(±s，n＝10)Table 2 Effects of herba patriniae on AST，ALT and ALP levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L)AST丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L)ALT堿性磷酸酶(U/L)ALP對照組Control gourp 0 187.34±27.31 31.80±5.12 115.74±8.53模型組Model group 0 342.66±15.77* 104.67±18.36* 158.47±14.25*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 310.38±12.03 94.51±18.79 145.33±12.86敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 287.32±10.58＃ 77.36±14.07＃ 132.34±9.85＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 230.78±11.57＃ 68.45±10.75＃ 112.53±15.31＃聯(lián)苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 227.86±10.91＃ 65.18±10.17＃ 110.76±9.34＃

2.4 敗醬草降低對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平

與對照組相比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草低、中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響(±s，n＝10)Table 3 Effects of herba patriniae on TNF-α，IL-6 and IL-1βlevels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表3 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響(±s，n＝10)Table 3 Effects of herba patriniae on TNF-α，IL-6 and IL-1βlevels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose腫瘤壞死因子α(pg/mL)TNF-α白介素6(pg/mL)IL-6白介素1β(pg/mL)IL-1β對照組Control gourp 0 141.36±5.37 49.72±12.51 24.32±4.33模型組Model group 0 357.93±6.57* 193.37±19.44* 159.16±4.52*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 196.86±5.53＃ 145.44±13.85＃ 140.97±5.63＃敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 161.85±6.41＃ 127.61±15.01＃ 94.85±5.17＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 121.74±6.36＃ 104.95±15.93＃ 52.60±4.47＃聯(lián)苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 149.19±6.74＃ 120.9±10.45＃ 40.27±3.25＃

2.5 敗醬草升高對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量

與對照組相比較，模型組SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.05)、MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比較，敗醬草低、中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.05)、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠SOD、MDA、GSH-Px含量的影響(±s，n＝10)Table 4 Effects of herba patriniae on SOD，MDA and GSH-Px levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表4 敗醬草對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠SOD、MDA、GSH-Px含量的影響(±s，n＝10)Table 4 Effects of herba patriniae on SOD，MDA and GSH-Px levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose總超氧化物歧化酶(U/mg Pro)SOD丙二醛(nmol/mg Pro)MDA谷胱甘肽過氧化物酶(U/mg Pro)GSH-Px對照組Control gourp 0 237.13±30.39 9.37±0.59 15.72±0.43模型組Model group 0 90.31±10.58* 11.25±0.42* 5.6±0.45*敗醬草低劑量組Low dose herba patriniae group 4 167.64±24.54＃ 10.82±0.89＃ 7.8±0.56＃敗醬草中劑量組Medium dose herba patriniae group 8 189.92±16.41＃ 10.17±0.62＃ 9.3±0.81＃敗醬草高劑量組High dose herba patriniae group 16 217.54±26.39＃ 9.54±0.93＃ 11.24±0.44＃聯(lián)苯雙酯組Bifendatatum group 0.3 226.71±16.73＃ 9.22±0.46＃ 13.18±0.32＃

3 討論

藥物性肝損傷又稱藥物性肝病，由于化學(xué)藥品數(shù)目增多及生物制劑和保健品的濫用，藥物性肝損傷的發(fā)病率呈上升趨勢[11]。建立APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷模型是研究藥物保肝護肝活性的經(jīng)典方法，以期進一步研究藥物性肝損傷的機制，為開發(fā)安全高效藥的新奠定基礎(chǔ)。本文研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草具有改善APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠病理損傷程度，降低肝臟指數(shù)的作用。

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)是常見的反應(yīng)肝損傷的生化標(biāo)志物，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性改變，AST、ALT、ALP釋放進入血液，導(dǎo)致血清中AST、ALT、ALP水平升高[12－13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草具有降低APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠AST、ALT、ALP水平的作用，提示敗醬草對APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠具有降酶保肝作用。

肝損傷嚴(yán)重程度取決于炎癥因子的釋放程度，由于炎癥反應(yīng)參與APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程，抑制炎癥因子的釋放有助于治療APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷[14]。IL-6屬于參與機體免疫應(yīng)答的炎癥因子，其含量升高可引發(fā)內(nèi)臟功能性損害，同時使T淋巴細(xì)胞增殖、分化，從而加劇機體炎癥反應(yīng)[15]。TNF-α是肝中重要的促炎、免疫調(diào)節(jié)因子，可引發(fā)肝組織炎細(xì)胞聚集，IL-1β在多種臟器中起重要作用，其高表達(dá)預(yù)示著炎癥的發(fā)生[16]。韓亮等[17]研究發(fā)現(xiàn)敗醬草通過下調(diào)TNFα、IL-1β水平減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸的組織學(xué)損傷程度。Seo等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃花敗醬提取物能抑制急性胰腺炎大鼠炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。本文研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草具有降低APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的作用。提示敗醬草抑制APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠炎癥因子的釋放。

APAP誘導(dǎo)藥物性肝損傷的過程中，大量的氧自由基量生成和氧化應(yīng)激次數(shù)的增多會加重肝損傷過程[19]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，測定MDA含量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，SOD在人體中水平高低可間接反映機體清除自由基的能力。測定MDA及SOD含量，可有助于分析肝損傷程度和肝修復(fù)能力。GSH-Px可衡量機體抗氧化能力強弱，測定肝組織中GSH-Px含量能較好的反映機體抗氧化的能力，間接反映肝細(xì)胞膜的修復(fù)程度[20]。孟良玉等[21]研究發(fā)現(xiàn)敗醬草提取物可顯著降低小鼠血清及組織MDA含量，提高SOD、GSH-Px和CAT活力。本文研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草具有升高APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量。提示敗醬草通過抗氧化應(yīng)激對APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷大鼠具有保護作用。

綜上所述，敗醬草通過改善肝組織病理損傷，降低血清生化酶水平，抑制炎癥因子的釋放，減輕氧化應(yīng)激水平對APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷模型大鼠具有保護作用。為臨床應(yīng)用敗醬草治療藥物性肝損傷提供了一定實驗依據(jù)，但敗醬草對APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷的具體分子作用機制還需進一步實驗探討。