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        多靶點抑制劑西奧羅尼增強人膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的機制*

        2021-10-20 08:03:44周玉玲劉志剛
        中國病理生理雜志 2021年9期
        關鍵詞:檢測

        何 超, 周玉玲, 王 榮, 魏 威, 劉志剛

        (中山大學附屬第五醫(yī)院腫瘤中心,廣東省生物醫(yī)學影像重點實驗室,廣東珠海 519000)

        多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是侵襲性較強的原發(fā)性惡性腫瘤,其中位生存期不到15 個月,5 年生存率不到4%[1]。GBM 患者的“標準治療”是先通過手術最大程度切除腫瘤,然后進行同步放化療后輔助替莫唑胺化療[2-3]。放射治療作為惡性膠質(zhì)瘤重要的治療方式,能有效的直接殺傷腫瘤細胞[4]。放射治療有劑量限制,增加總放射劑量會增加放射損傷副作用[5]。此外,GBM 單純放療的治療效果欠佳[6]。因此,需要尋找放療增敏劑以期提高放療的治療效果[1]。

        西奧羅尼(chiauranib)是一種多靶點選擇性激酶抑制劑,已報道的靶點是血管生成相關激酶,包括血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)1、2、3和c-Kit,慢性炎癥相關激酶集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor-1 receptor,CSF-1R)和有絲分裂相關激酶Aurora B[8-10]。研究表明,西奧羅尼可以通過抑制VEGFR2 和Aurora B 來減少肝細胞癌和胃癌細胞的增殖[11]。此外,西奧羅尼還可以通過抑制急性髓細胞性白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)和非霍奇金淋巴瘤的血管生成和有絲分裂來抑制腫瘤的增殖[8-9]。由于西奧羅尼的抑制血管生成等作用可以抑制腫瘤生長,因此西奧羅尼與其他治療方式(如放療)聯(lián)合使用有可能會獲得更好的抗腫瘤作用。本研究通過西奧羅尼聯(lián)合X 射線處理人膠質(zhì)瘤細胞,探索西奧羅尼對人膠質(zhì)瘤細胞的放射增敏作用及其作用機制。

        材 料 和 方 法

        1 細胞、主要試劑和儀器

        人膠質(zhì)瘤U251 細胞和T98G 細胞購于上海吉凱基因公司。

        兔抗人CSF-1R 和p-CSF-1R 抗體購于Abcam;兔抗 人Cdc2、p-Cdc2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP、γH2AX、AKT、p-AKT、CHK2 和p-CHK2 抗體,以及HRP 標記的山羊抗兔IgG 購于Cell Signaling Technology;高糖DMEM 培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶和胎牛血清購于Gibco;CCK-8試劑盒購于MedChemExpress;細胞周期試劑盒和凋亡試劑盒購于BD。

        酶標儀(Molecular Devices);水平凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad);熒光顯微鏡(Nikon);流式細胞儀(Beckman)。

        2 實驗方法

        2.1 細胞培養(yǎng) 將U251 細胞和T98G 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        2.2 輻照條件和劑量 使用Infinity linear accelerator(Elekta)對U251 細胞和T98G 細胞進行不同劑量(0、2、4 和6 Gy)的輻照,劑量率為500 MU/min,靶源距為100 cm。

        2.3 細胞活力的檢測 將U251 細胞和T98G 細胞以每孔3×103個的細胞密度均勻接種于96孔板中,并用不同濃度的西奧羅尼(0、2.5、5、10、20 和40 μmol/L)處理細胞,然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待0 μmol/L 組細胞融合度達80%左右,進行檢測。檢測前棄舊培養(yǎng)基,用新鮮培養(yǎng)基以1∶10稀釋CCK-8,并將100 μL 稀釋液添加到每個孔中。在37 ℃下孵育2 h,用酶標儀在波長450 nm 處測量吸光度(A)值。得到對應吸光度值后用GraphPad Prism 8.0 軟件計算出該藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

        2.4 平板集落形成實驗 6孔板中分別均勻接種一定數(shù)量的U251 細胞和T98G 細胞,并且每孔分別用西奧羅尼、X 射線和二者聯(lián)合處理。空白組、2 Gy 處理組、4 Gy 處理組和6 Gy 處理組的接種細胞數(shù)分別為400、400、600 和800 個。接種24 h 后,棄舊培養(yǎng)基換成含有西奧羅尼的新鮮培養(yǎng)基。接種48 h 后,將細胞用X 射線(2、4 和6 Gy)處理。然后將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d。顯微鏡下觀察集落細胞數(shù)達50個以上后,棄舊培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛(Bioss)固定15 min,然后用0.05%結(jié)晶紫(Sigma Life Science)染色過夜。然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。再用肉眼對細胞集落進行計數(shù)。后用使用Graph-Pad Prism 8.0軟件,將4個獨立實驗的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤(mean±SEM),并根據(jù)線性-二次模型(linear-quadratic model,L-Q)進行分析并繪制存活曲線。

        2.5 細胞周期和細胞凋亡分析 將U251 細胞和T98G 細胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中,按照上述分組在第2 天和第3 天分別用西奧羅尼(2.5 μmol/L)和X 射線(4Gy)處理。在第4 天,用預冷的70%乙醇固定樣品過夜,并在測試前用碘化丙啶(PI)室溫避光染色15 min,然后用流式細胞術進行細胞周期檢測。將U251 細胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中,按照上述分組在第2 天和第3 天分別用西奧羅尼(2.5 μmol/L)和X 射線(4 Gy)處理。在第5 天,用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶(1×)消化細胞后,用annexin V-FITC 染色15 min,然后用流式細胞術進行細胞凋亡檢測。流式細胞儀用于細胞周期和凋亡檢測,ModFit LT 3.0(Verify Software House)和FlowJo 10.0(BD Biosciences)用于分析細胞周期和凋亡數(shù)據(jù)。

        2.6 Western blot 檢測蛋白水平 用于Western blot實驗的U251 細胞的處理方式與用于細胞周期檢測的細胞相同。在第5 天,每個皿加入100 μL 冰冷的裂解緩沖液以裂解細胞。進行BCA 蛋白定量測定,并用5× loading buffer 稀釋樣品。然后在SDS-PAGE凝膠上樣,并通過濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用10%脫脂牛奶阻斷非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合。將PVDF 膜置于含相應Ⅰ抗的溶液中于4 ℃孵育過夜(稀釋度1∶1 000)。在第2 天,將PVDF 膜置于含對應Ⅱ抗的溶液中室溫下孵育1 h,然后進行化學發(fā)光檢測蛋白信號。

        2.7 免疫熒光實驗 將潔凈無菌的細胞爬片置于24 孔板底,然后將U251 細胞和T98G 細胞以每孔5×103個的細胞密度接種到24孔板中,同時在每孔加入干凈的細胞爬片。設對照組和西奧羅尼(2.5 μmol/L)組,然后進行輻照處理(4 Gy)處理。在第4 天,用4%多聚甲醛將細胞室溫固定30 min,用PBS 洗5min×3遍。使用0.5%Triton-100進行細胞室溫透膜20min,再用PBS洗5 min×3遍。用5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉1 h,然后將爬片置于含γH2AX抗體(CST,稀釋度為1∶500)的溶液在4 ℃孵育過夜。次日,用PBS清洗爬片5 min×3遍,后將爬片置于熒光團偶聯(lián)的Ⅱ抗(CST,稀釋度為1∶400)在室溫下避光孵育1 h。再用PBS 清洗爬片5 min×3遍。最后,用DAPI對細胞核進行染色,并將爬片固定在載玻片上,并置于黑暗環(huán)境中。然后使用熒光顯微鏡采集圖像,并將其導入到ImageJ 分析軟件(NIH)中。

        3 統(tǒng)計學處理

        所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性檢驗,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后,進行方差齊性檢驗,最后使用SPSS 17.0 進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05可認為差異具有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        1 西奧羅尼抑制人膠質(zhì)瘤細胞增殖并增強其放射敏感性

        既往報道西奧羅尼可以通過抑制慢性炎癥相關激酶CSF-1R 來起作用[8]。通過Western blot 發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度的增加,CSF-1R在U251細胞的表達量沒有明顯改變,而p-CSF-1R 的水平逐漸降低(圖1A)。通過CCK-8 實驗分析驗證了西奧羅尼對U251 細胞和T98G 細胞活力的抑制作用,結(jié)果如圖1B、C 所示,隨著西奧羅尼濃度的增加,U251 細胞和T98G 細胞的活力受到明顯抑制,計算出U251 細胞和T98G 細胞的IC50分別為7.773 μmol/L 和24.68 μmol/L,并確定了30%的抑制率對應的濃度2.5 μmol/L 可用作進一步實驗的藥物濃度。

        用X 射線(0、2、4 和6 Gy)或聯(lián)合西奧羅尼(2.5 μmol/L)處理U251 細胞和T98G 細胞,并通過集落形成的實驗結(jié)果分析了細胞存活效率。U251 細胞單純X 射線輻照組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為(16.670±3.987)%、(7.667±1.627)%、(3.889±0.385)%和(0.917±0.260)%,聯(lián)合西奧羅尼組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為(9.167±1.942)% 、(3.803±0.629)% 、(1.722±0.509)% 和(0.875±0.354)%。T98G 細胞單純X 射線輻照組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為(14.580±0.882)% 、(6.367±0.741)% 、(4.056±0.434)% 和(2.000±1.444)%,聯(lián)合西奧羅尼組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為(6.333±1.710)%、(4.167±0.221)%、(1.167±0.962)%和(0.583±0.150)%。對集落形成結(jié)果進行L-Q 擬合,結(jié)果表明西奧羅尼聯(lián)合X 射線組的抑制增殖作用比單獨X 射線組更明顯,計算出西奧羅尼對U251 細胞和T98G 細胞的放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)分別為1.387 和1.384,這表明西奧羅尼可增強人膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性,見圖1D、E。

        Figure 1. Chiauranib inhibited the proliferation of glioma cells and enhances their radiosensitivity. A:the protein level of p-CSF-1R in U251 cells exposed to different concentrations of chiauranib was detected by Western blot;B and C:the viabily of U251 and T98G cells exposed to chiauranib was measured by CCK-8 assay;D and E:the linear-quadratic fitting curves of colony formation of U251 and T98G cells treated with different doses of irradiation. Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 西奧羅尼抑制人膠質(zhì)瘤細胞的增殖并增強其放射敏感性

        2 西奧羅尼增強輻射誘導的人膠質(zhì)瘤細胞G2/M 期阻滯

        為探索西奧羅尼聯(lián)合X 射線增強膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的機制,分別用流式細胞術和Western blot檢測細胞周期相關蛋白水平的變化。將U251 細胞和T98G 細胞單獨用X 射線(4 Gy)或西奧羅尼(2.5 μmol/L)或二者聯(lián)合聯(lián)合處理24 h 后,用流式細胞術進行細胞周期檢測。與對照組相比,4 Gy 輻照組、西奧羅尼2.5 μmol/L 組以及西奧羅尼2.5 μmol/L 聯(lián)合4 Gy 輻照組均引起G2/M 期阻滯,并且聯(lián)合組的G2/M期阻滯作用更強[U251:(23.96±1.18)%;T98G:(6.54±0.13)%],見圖2A。Western blot 結(jié)果提示,與對照組對比,周期相關蛋白p-Cdc2 的水平在其余3組均降低,并且聯(lián)合組降低最明顯,見圖2B。

        Figure 2. Chiauranib combined with X-ray irradiation caused cell cycle arrest in glioma cells. A:the cell cycle distribution of U251 and T98G cells was measured by flow cytometry;B:the protein levels of Cdc2 and p-Cdc2 in U251 cells treated with chiauranib(2.5 μmol/L)or/and X-ray(4 Gy)were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs vehicle group.圖2 西奧羅尼聯(lián)合X射線造成人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯

        3 西奧羅尼聯(lián)合X 射線促進人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡

        為了進一步探索西奧羅尼聯(lián)合X 射線增強膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的機制,將U251 細胞單獨用X 射線(4 Gy)或西奧羅尼(2.5 μmol/L)處理,或二者聯(lián)合處理48 h 后,與對照組相比,X 射線輻照組、西奧羅尼組和聯(lián)合組均檢測到更多的凋亡細胞,并且聯(lián)合組檢測到最多的凋亡細胞[U251:(21.22±0.38)%;T98G:(21.32±0.64)],見圖3A。此外,我們通過Western blot 檢測了多種與細胞凋亡相關的蛋白,與對照組相比,其余3組的caspase-3和PARP 的蛋白水平的差異沒有統(tǒng)計學顯著性,但是cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平顯著升高,見圖3B。

        Figure 3. Chiauranib combined with X-ray irradiation induced apoptosis of glioma cells. A:the apoptosis of U251 and T98G cells was detected by flow cytometry;B:the protein levels of cleaved caspase-3 and cleaved PARP in U251 cells treated with chiauranib(2.5 μmol/L)or/and X-ray(4 Gy)were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P<0.05 vs vehicle group.圖3 西奧羅尼聯(lián)合X射線誘導人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生細胞凋亡

        4 西奧羅尼聯(lián)合X射線促進DNA損傷和延緩DNA修復進程

        免疫熒光實驗結(jié)果顯示,在30 min,γH2AX 熒光灶點在單純輻照組和聯(lián)合組中均十分明顯,并且聯(lián)合組的熒光強度更強;在6 h 和24 h,γH2AX 熒光灶點在X 射線輻照組中逐漸減少,而在聯(lián)合組中可以觀察到γH2AX 熒光灶點,進而證明了西奧羅尼延遲了U251 細胞和T98G 細胞的DNA 損傷修復進程,見圖4A、B。隨后,通過Western blot 檢測了DNA 損傷修復的關鍵蛋白,結(jié)果提示CHK2和AKT在4組中的變化不顯著,但是聯(lián)合組的p-CHK2 和γH2AX 的蛋白水平顯著升高,p-AKT 的蛋白水平顯著降低,見圖4C。

        Figure 4. Chiauranib combined with X-ray irradiation inhibited the DNA damage and repair process of glioma cells. A:the process of DNA damage and repair in U251 cells was observed by immunofluorescence;B:the process of DNA damage and repair in T98G cells was observed by immunofluorescence;C:the protein levels of γH2AX,p-AKT and p-CHK2 in U251 cells treated with chiauranib(2.5 μmol/L)or/and X-ray(4 Gy)were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.#P<0.05 vs 4 Gy group;*P<0.05 vs vehicle group.圖4 西奧羅尼聯(lián)合X射線抑制人膠質(zhì)瘤細胞DNA損傷和修復進程

        討 論

        膠質(zhì)瘤是一種血運豐富的腫瘤[8,12]。西奧羅尼是一種新型的多靶點抑制劑,可通過抑制血管生成、有絲分裂和慢性炎癥來抑制腫瘤的生長[13]。除此之外,它的抑制作用具有很高的選擇性,對其他正常功能激酶、蛋白質(zhì)和離子通道的影響很?。?3]。西奧羅尼也通過誘導VEGFR2 的失活及其下游信號級聯(lián)以促進凋亡來抑制AML 細胞的增殖[9]。還有研究發(fā)現(xiàn),西奧羅尼可以通過抑制Aurora B 的體內(nèi)抗有絲分裂作用而導致細胞G2/M期阻滯[12]。由于西奧羅尼的抑制血管生成等作用可以抑制腫瘤生長,因此西奧羅尼與其他治療方式(如放療)聯(lián)合使用有可能會獲得更好的抗腫瘤作用。因此本研究的目的是探索西奧羅尼對人膠質(zhì)瘤細胞的放射增敏作用及其機制。本研究通過CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn),隨著西奧羅尼的藥物濃度增高,人膠質(zhì)瘤細胞的生長明顯受到抑制,結(jié)合集落形成實驗的結(jié)果,可以認定西奧羅尼具有抑制人膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用。

        放療作為膠質(zhì)母細胞瘤重要的治療方式,在臨床上應用廣泛。但是提高放射總劑量會對腫瘤組織周邊的正常組織造成損害,因而放療增敏劑成為了膠質(zhì)瘤治療的研究熱點。為進一步探索西奧羅尼是否可以增加膠質(zhì)瘤U251 的放射敏感性,本研究進行了集落形成實驗,將結(jié)果繪制成生存曲線,通過線性-二次方程算出了放療SER。從而證明西奧羅尼可以增加人膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的作用。除此之外,本研究通過流式細胞術檢測凋亡情況證實了西奧羅尼聯(lián)合X 射線能顯著提高細胞凋亡率。caspase-3 是caspase 蛋白家族的一員,在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。PARP 是caspase-3 裂解的基本底物之一,它是一種DNA 結(jié)合酶,其表達提示DNA 雙鏈發(fā)生斷裂[15]。本研究通過Western blot 檢測證實caspase-3 和PARP 的蛋白水平在4 組沒有明顯差異,而cleaved caspase-3和cleaved PARP 的水平在X 射線輻照組、西奧羅尼組和聯(lián)合組中均顯著增高,并且聯(lián)合組中表達量最高,這意味著與單純X 射線輻照組相比,西奧羅尼聯(lián)合X 射線能更容易誘導U251 細胞發(fā)生凋亡。

        DNA 雙鏈發(fā)生斷裂,是放療殺傷腫瘤的重要機制[16-17]。腫瘤細胞啟動DNA 損傷修復機制,需要激活細胞周期檢查點[18-19]。我們通過細胞周期檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,X 射線輻照組、西奧羅尼組和聯(lián)合組都出現(xiàn)了G2/M 期阻滯,并且聯(lián)合組的G2/M 期阻滯的細胞最多,而S 期細胞最少。眾所周知,腫瘤細胞在G2/M 期對X 射線最敏感,G1期相對不敏感,而S期最不敏感[20],因而西奧羅尼可以作為良好的放療增敏劑。Cdc2 參與周期檢查點調(diào)控,當其調(diào)節(jié)異常時,可能導致腫瘤細胞的染色體不穩(wěn)定[21]。通過Western blot 檢測Cdc2 蛋白的水平發(fā)現(xiàn),與對照組相比,其他3組Cdc2的水平不變,而p-Cdc2的水平都降低,并且聯(lián)合組的水平最低。通過免疫熒光實驗驗證了西奧羅尼聯(lián)合X 射線,可以誘導人膠質(zhì)瘤U251細胞DNA 損傷和延遲修復進程。γH2AX 是募集DNA 損傷的載體可以募集下游修復蛋白至DNA 損傷部位進行修復[6]。通過Western blot 檢測γH2AX、AKT 和CHK2等蛋白,進一步證明了西奧羅尼聯(lián)合X射線能誘導U251 細胞發(fā)生DNA 損傷和延遲DNA 修復進程。

        綜上所述,西奧羅尼可以抑制人膠質(zhì)瘤細胞的增殖,并且增強其放射敏感性。研究發(fā)現(xiàn)西奧羅尼是通過誘導人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生G2/M 期阻滯、促進細胞凋亡、誘導DNA 損傷及延遲修復進程來起作用的。本研究為西奧羅尼作為潛在放療增敏劑在臨床膠質(zhì)瘤治療上的應用提供實驗基礎和理論依據(jù)。

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