何 超， 周玉玲， 王 榮， 魏 威， 劉志剛

（中山大學附屬第五醫(yī)院腫瘤中心，廣東省生物醫(yī)學影像重點實驗室，廣東珠海 519000）

多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是侵襲性較強的原發(fā)性惡性腫瘤，其中位生存期不到15 個月，5 年生存率不到4%［1］。GBM 患者的“標準治療”是先通過手術最大程度切除腫瘤，然后進行同步放化療后輔助替莫唑胺化療［2-3］。放射治療作為惡性膠質(zhì)瘤重要的治療方式，能有效的直接殺傷腫瘤細胞［4］。放射治療有劑量限制，增加總放射劑量會增加放射損傷副作用［5］。此外，GBM 單純放療的治療效果欠佳［6］。因此，需要尋找放療增敏劑以期提高放療的治療效果［1］。

西奧羅尼（chiauranib）是一種多靶點選擇性激酶抑制劑，已報道的靶點是血管生成相關激酶，包括血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）1、2、3和c-Kit，慢性炎癥相關激酶集落刺激因子1受體（colony-stimulating factor-1 receptor，CSF-1R）和有絲分裂相關激酶Aurora B［8-10］。研究表明，西奧羅尼可以通過抑制VEGFR2 和Aurora B 來減少肝細胞癌和胃癌細胞的增殖［11］。此外，西奧羅尼還可以通過抑制急性髓細胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）和非霍奇金淋巴瘤的血管生成和有絲分裂來抑制腫瘤的增殖［8-9］。由于西奧羅尼的抑制血管生成等作用可以抑制腫瘤生長，因此西奧羅尼與其他治療方式（如放療）聯(lián)合使用有可能會獲得更好的抗腫瘤作用。本研究通過西奧羅尼聯(lián)合X 射線處理人膠質(zhì)瘤細胞，探索西奧羅尼對人膠質(zhì)瘤細胞的放射增敏作用及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 細胞、主要試劑和儀器

人膠質(zhì)瘤U251 細胞和T98G 細胞購于上海吉凱基因公司。

兔抗人CSF-1R 和p-CSF-1R 抗體購于Abcam；兔抗 人Cdc2、p-Cdc2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP、γH2AX、AKT、p-AKT、CHK2 和p-CHK2 抗體，以及HRP 標記的山羊抗兔IgG 購于Cell Signaling Technology；高糖DMEM 培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶和胎牛血清購于Gibco；CCK-8試劑盒購于MedChemExpress；細胞周期試劑盒和凋亡試劑盒購于BD。

酶標儀（Molecular Devices）；水平凝膠電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）；熒光顯微鏡（Nikon）；流式細胞儀（Beckman）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將U251 細胞和T98G 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 輻照條件和劑量 使用Infinity linear accelerator（Elekta）對U251 細胞和T98G 細胞進行不同劑量（0、2、4 和6 Gy）的輻照，劑量率為500 MU/min，靶源距為100 cm。

2.3 細胞活力的檢測 將U251 細胞和T98G 細胞以每孔3×103個的細胞密度均勻接種于96孔板中，并用不同濃度的西奧羅尼（0、2.5、5、10、20 和40 μmol/L）處理細胞，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待0 μmol/L 組細胞融合度達80%左右，進行檢測。檢測前棄舊培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基以1∶10稀釋CCK-8，并將100 μL 稀釋液添加到每個孔中。在37 ℃下孵育2 h，用酶標儀在波長450 nm 處測量吸光度（A）值。得到對應吸光度值后用GraphPad Prism 8.0 軟件計算出該藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 平板集落形成實驗 6孔板中分別均勻接種一定數(shù)量的U251 細胞和T98G 細胞，并且每孔分別用西奧羅尼、X 射線和二者聯(lián)合處理。空白組、2 Gy 處理組、4 Gy 處理組和6 Gy 處理組的接種細胞數(shù)分別為400、400、600 和800 個。接種24 h 后，棄舊培養(yǎng)基換成含有西奧羅尼的新鮮培養(yǎng)基。接種48 h 后，將細胞用X 射線（2、4 和6 Gy）處理。然后將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d。顯微鏡下觀察集落細胞數(shù)達50個以上后，棄舊培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛（Bioss）固定15 min，然后用0.05%結(jié)晶紫（Sigma Life Science）染色過夜。然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。再用肉眼對細胞集落進行計數(shù)。后用使用Graph-Pad Prism 8.0軟件，將4個獨立實驗的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤（mean±SEM），并根據(jù)線性-二次模型（linear-quadratic model，L-Q）進行分析并繪制存活曲線。

2.5 細胞周期和細胞凋亡分析 將U251 細胞和T98G 細胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中，按照上述分組在第2 天和第3 天分別用西奧羅尼（2.5 μmol/L）和X 射線（4Gy）處理。在第4 天，用預冷的70%乙醇固定樣品過夜，并在測試前用碘化丙啶（PI）室溫避光染色15 min，然后用流式細胞術進行細胞周期檢測。將U251 細胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中，按照上述分組在第2 天和第3 天分別用西奧羅尼（2.5 μmol/L）和X 射線（4 Gy）處理。在第5 天，用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶（1×）消化細胞后，用annexin V-FITC 染色15 min，然后用流式細胞術進行細胞凋亡檢測。流式細胞儀用于細胞周期和凋亡檢測，ModFit LT 3.0（Verify Software House）和FlowJo 10.0（BD Biosciences）用于分析細胞周期和凋亡數(shù)據(jù)。

2.6 Western blot 檢測蛋白水平 用于Western blot實驗的U251 細胞的處理方式與用于細胞周期檢測的細胞相同。在第5 天，每個皿加入100 μL 冰冷的裂解緩沖液以裂解細胞。進行BCA 蛋白定量測定，并用5× loading buffer 稀釋樣品。然后在SDS-PAGE凝膠上樣，并通過濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用10%脫脂牛奶阻斷非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合。將PVDF 膜置于含相應Ⅰ抗的溶液中于4 ℃孵育過夜（稀釋度1∶1 000）。在第2 天，將PVDF 膜置于含對應Ⅱ抗的溶液中室溫下孵育1 h，然后進行化學發(fā)光檢測蛋白信號。

2.7 免疫熒光實驗 將潔凈無菌的細胞爬片置于24 孔板底，然后將U251 細胞和T98G 細胞以每孔5×103個的細胞密度接種到24孔板中，同時在每孔加入干凈的細胞爬片。設對照組和西奧羅尼（2.5 μmol/L）組，然后進行輻照處理（4 Gy）處理。在第4 天，用4%多聚甲醛將細胞室溫固定30 min，用PBS 洗5min×3遍。使用0.5%Triton-100進行細胞室溫透膜20min，再用PBS洗5 min×3遍。用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h，然后將爬片置于含γH2AX抗體（CST，稀釋度為1∶500）的溶液在4 ℃孵育過夜。次日，用PBS清洗爬片5 min×3遍，后將爬片置于熒光團偶聯(lián)的Ⅱ抗（CST，稀釋度為1∶400）在室溫下避光孵育1 h。再用PBS 清洗爬片5 min×3遍。最后，用DAPI對細胞核進行染色，并將爬片固定在載玻片上，并置于黑暗環(huán)境中。然后使用熒光顯微鏡采集圖像，并將其導入到ImageJ 分析軟件（NIH）中。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，進行方差齊性檢驗，最后使用SPSS 17.0 進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05可認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 西奧羅尼抑制人膠質(zhì)瘤細胞增殖并增強其放射敏感性

既往報道西奧羅尼可以通過抑制慢性炎癥相關激酶CSF-1R 來起作用［8］。通過Western blot 發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，CSF-1R在U251細胞的表達量沒有明顯改變，而p-CSF-1R 的水平逐漸降低（圖1A）。通過CCK-8 實驗分析驗證了西奧羅尼對U251 細胞和T98G 細胞活力的抑制作用，結(jié)果如圖1B、C 所示，隨著西奧羅尼濃度的增加，U251 細胞和T98G 細胞的活力受到明顯抑制，計算出U251 細胞和T98G 細胞的IC50分別為7.773 μmol/L 和24.68 μmol/L，并確定了30%的抑制率對應的濃度2.5 μmol/L 可用作進一步實驗的藥物濃度。

用X 射線（0、2、4 和6 Gy）或聯(lián)合西奧羅尼（2.5 μmol/L）處理U251 細胞和T98G 細胞，并通過集落形成的實驗結(jié)果分析了細胞存活效率。U251 細胞單純X 射線輻照組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為（16.670±3.987）%、（7.667±1.627）%、（3.889±0.385）%和（0.917±0.260）%，聯(lián)合西奧羅尼組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為（9.167±1.942）% 、（3.803±0.629）% 、（1.722±0.509）% 和（0.875±0.354）%。T98G 細胞單純X 射線輻照組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為（14.580±0.882）% 、（6.367±0.741）% 、（4.056±0.434）% 和（2.000±1.444）%，聯(lián)合西奧羅尼組在不同輻照劑量下的集落形成率分別為（6.333±1.710）%、（4.167±0.221）%、（1.167±0.962）%和（0.583±0.150）%。對集落形成結(jié)果進行L-Q 擬合，結(jié)果表明西奧羅尼聯(lián)合X 射線組的抑制增殖作用比單獨X 射線組更明顯，計算出西奧羅尼對U251 細胞和T98G 細胞的放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）分別為1.387 和1.384，這表明西奧羅尼可增強人膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性，見圖1D、E。

Figure 1. Chiauranib inhibited the proliferation of glioma cells and enhances their radiosensitivity. A：the protein level of p-CSF-1R in U251 cells exposed to different concentrations of chiauranib was detected by Western blot；B and C：the viabily of U251 and T98G cells exposed to chiauranib was measured by CCK-8 assay；D and E：the linear-quadratic fitting curves of colony formation of U251 and T98G cells treated with different doses of irradiation. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 西奧羅尼抑制人膠質(zhì)瘤細胞的增殖并增強其放射敏感性

2 西奧羅尼增強輻射誘導的人膠質(zhì)瘤細胞G2/M 期阻滯

為探索西奧羅尼聯(lián)合X 射線增強膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的機制，分別用流式細胞術和Western blot檢測細胞周期相關蛋白水平的變化。將U251 細胞和T98G 細胞單獨用X 射線（4 Gy）或西奧羅尼（2.5 μmol/L）或二者聯(lián)合聯(lián)合處理24 h 后，用流式細胞術進行細胞周期檢測。與對照組相比，4 Gy 輻照組、西奧羅尼2.5 μmol/L 組以及西奧羅尼2.5 μmol/L 聯(lián)合4 Gy 輻照組均引起G2/M 期阻滯，并且聯(lián)合組的G2/M期阻滯作用更強［U251：（23.96±1.18）%；T98G：（6.54±0.13）%］，見圖2A。Western blot 結(jié)果提示，與對照組對比，周期相關蛋白p-Cdc2 的水平在其余3組均降低，并且聯(lián)合組降低最明顯，見圖2B。

Figure 2. Chiauranib combined with X-ray irradiation caused cell cycle arrest in glioma cells. A：the cell cycle distribution of U251 and T98G cells was measured by flow cytometry；B：the protein levels of Cdc2 and p-Cdc2 in U251 cells treated with chiauranib（2.5 μmol/L）or/and X-ray（4 Gy）were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vehicle group.圖2 西奧羅尼聯(lián)合X射線造成人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯

3 西奧羅尼聯(lián)合X 射線促進人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡

為了進一步探索西奧羅尼聯(lián)合X 射線增強膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的機制，將U251 細胞單獨用X 射線（4 Gy）或西奧羅尼（2.5 μmol/L）處理，或二者聯(lián)合處理48 h 后，與對照組相比，X 射線輻照組、西奧羅尼組和聯(lián)合組均檢測到更多的凋亡細胞，并且聯(lián)合組檢測到最多的凋亡細胞［U251：（21.22±0.38）%；T98G：（21.32±0.64）］，見圖3A。此外，我們通過Western blot 檢測了多種與細胞凋亡相關的蛋白，與對照組相比，其余3組的caspase-3和PARP 的蛋白水平的差異沒有統(tǒng)計學顯著性，但是cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平顯著升高，見圖3B。

Figure 3. Chiauranib combined with X-ray irradiation induced apoptosis of glioma cells. A：the apoptosis of U251 and T98G cells was detected by flow cytometry；B：the protein levels of cleaved caspase-3 and cleaved PARP in U251 cells treated with chiauranib（2.5 μmol/L）or/and X-ray（4 Gy）were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vehicle group.圖3 西奧羅尼聯(lián)合X射線誘導人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生細胞凋亡

4 西奧羅尼聯(lián)合X射線促進DNA損傷和延緩DNA修復進程

免疫熒光實驗結(jié)果顯示，在30 min，γH2AX 熒光灶點在單純輻照組和聯(lián)合組中均十分明顯，并且聯(lián)合組的熒光強度更強；在6 h 和24 h，γH2AX 熒光灶點在X 射線輻照組中逐漸減少，而在聯(lián)合組中可以觀察到γH2AX 熒光灶點，進而證明了西奧羅尼延遲了U251 細胞和T98G 細胞的DNA 損傷修復進程，見圖4A、B。隨后，通過Western blot 檢測了DNA 損傷修復的關鍵蛋白，結(jié)果提示CHK2和AKT在4組中的變化不顯著，但是聯(lián)合組的p-CHK2 和γH2AX 的蛋白水平顯著升高，p-AKT 的蛋白水平顯著降低，見圖4C。

Figure 4. Chiauranib combined with X-ray irradiation inhibited the DNA damage and repair process of glioma cells. A：the process of DNA damage and repair in U251 cells was observed by immunofluorescence；B：the process of DNA damage and repair in T98G cells was observed by immunofluorescence；C：the protein levels of γH2AX，p-AKT and p-CHK2 in U251 cells treated with chiauranib（2.5 μmol/L）or/and X-ray（4 Gy）were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.#P＜0.05 vs 4 Gy group；*P＜0.05 vs vehicle group.圖4 西奧羅尼聯(lián)合X射線抑制人膠質(zhì)瘤細胞DNA損傷和修復進程

討 論

膠質(zhì)瘤是一種血運豐富的腫瘤［8，12］。西奧羅尼是一種新型的多靶點抑制劑，可通過抑制血管生成、有絲分裂和慢性炎癥來抑制腫瘤的生長［13］。除此之外，它的抑制作用具有很高的選擇性，對其他正常功能激酶、蛋白質(zhì)和離子通道的影響很?。?3］。西奧羅尼也通過誘導VEGFR2 的失活及其下游信號級聯(lián)以促進凋亡來抑制AML 細胞的增殖［9］。還有研究發(fā)現(xiàn)，西奧羅尼可以通過抑制Aurora B 的體內(nèi)抗有絲分裂作用而導致細胞G2/M期阻滯［12］。由于西奧羅尼的抑制血管生成等作用可以抑制腫瘤生長，因此西奧羅尼與其他治療方式（如放療）聯(lián)合使用有可能會獲得更好的抗腫瘤作用。因此本研究的目的是探索西奧羅尼對人膠質(zhì)瘤細胞的放射增敏作用及其機制。本研究通過CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn)，隨著西奧羅尼的藥物濃度增高，人膠質(zhì)瘤細胞的生長明顯受到抑制，結(jié)合集落形成實驗的結(jié)果，可以認定西奧羅尼具有抑制人膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用。

放療作為膠質(zhì)母細胞瘤重要的治療方式，在臨床上應用廣泛。但是提高放射總劑量會對腫瘤組織周邊的正常組織造成損害，因而放療增敏劑成為了膠質(zhì)瘤治療的研究熱點。為進一步探索西奧羅尼是否可以增加膠質(zhì)瘤U251 的放射敏感性，本研究進行了集落形成實驗，將結(jié)果繪制成生存曲線，通過線性-二次方程算出了放療SER。從而證明西奧羅尼可以增加人膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性的作用。除此之外，本研究通過流式細胞術檢測凋亡情況證實了西奧羅尼聯(lián)合X 射線能顯著提高細胞凋亡率。caspase-3 是caspase 蛋白家族的一員，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［14］。PARP 是caspase-3 裂解的基本底物之一，它是一種DNA 結(jié)合酶，其表達提示DNA 雙鏈發(fā)生斷裂［15］。本研究通過Western blot 檢測證實caspase-3 和PARP 的蛋白水平在4 組沒有明顯差異，而cleaved caspase-3和cleaved PARP 的水平在X 射線輻照組、西奧羅尼組和聯(lián)合組中均顯著增高，并且聯(lián)合組中表達量最高，這意味著與單純X 射線輻照組相比，西奧羅尼聯(lián)合X 射線能更容易誘導U251 細胞發(fā)生凋亡。

DNA 雙鏈發(fā)生斷裂，是放療殺傷腫瘤的重要機制［16-17］。腫瘤細胞啟動DNA 損傷修復機制，需要激活細胞周期檢查點［18-19］。我們通過細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，X 射線輻照組、西奧羅尼組和聯(lián)合組都出現(xiàn)了G2/M 期阻滯，并且聯(lián)合組的G2/M 期阻滯的細胞最多，而S 期細胞最少。眾所周知，腫瘤細胞在G2/M 期對X 射線最敏感，G1期相對不敏感，而S期最不敏感［20］，因而西奧羅尼可以作為良好的放療增敏劑。Cdc2 參與周期檢查點調(diào)控，當其調(diào)節(jié)異常時，可能導致腫瘤細胞的染色體不穩(wěn)定［21］。通過Western blot 檢測Cdc2 蛋白的水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其他3組Cdc2的水平不變，而p-Cdc2的水平都降低，并且聯(lián)合組的水平最低。通過免疫熒光實驗驗證了西奧羅尼聯(lián)合X 射線，可以誘導人膠質(zhì)瘤U251細胞DNA 損傷和延遲修復進程。γH2AX 是募集DNA 損傷的載體可以募集下游修復蛋白至DNA 損傷部位進行修復［6］。通過Western blot 檢測γH2AX、AKT 和CHK2等蛋白，進一步證明了西奧羅尼聯(lián)合X射線能誘導U251 細胞發(fā)生DNA 損傷和延遲DNA 修復進程。

綜上所述，西奧羅尼可以抑制人膠質(zhì)瘤細胞的增殖，并且增強其放射敏感性。研究發(fā)現(xiàn)西奧羅尼是通過誘導人膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生G2/M 期阻滯、促進細胞凋亡、誘導DNA 損傷及延遲修復進程來起作用的。本研究為西奧羅尼作為潛在放療增敏劑在臨床膠質(zhì)瘤治療上的應用提供實驗基礎和理論依據(jù)。