高薔， 王龍飛， 鄧林紅， 王翔

(常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164)

1 引 言

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和氣道壁重構(gòu)為特征的慢性阻塞性氣道疾病。雖然其發(fā)病機理尚不清楚[1]，但已有研究表明作為氣道壁的重要組成部分，氣道平滑肌細胞(ASMC)是哮喘發(fā)生時導(dǎo)致氣道狹窄的主要效應(yīng)細胞。ASMC的異常收縮增加了氣道內(nèi)部的機械應(yīng)力，使氣道狹窄[2]。因此，ASMC是治療哮喘的主要靶細胞[2-4]。臨床上舒張ASMC的藥物主要包括β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、膽堿受體拮抗劑等[3,5-7]。例如，鹽酸異丙腎上腺素(ISO，一種β2受體激動劑)通過與ASMC的β2受體結(jié)合，引發(fā)ASMC產(chǎn)生cAMP信號分子，進而導(dǎo)致ASMC松弛[8-10]。然而，此類藥物具有導(dǎo)致心律失常、低氧血癥等副作用，長期使用還會導(dǎo)致ASMC的舒張能力下降，使哮喘進一步惡化。因此，篩選新一代的靶向氣道平滑肌的舒張藥物非常重要，而如何準確、快速測量藥物的細胞舒張效應(yīng)是評價藥物有效性的關(guān)鍵。

目前已建立了從動物到細胞水平的多種用于評價ASMC舒張藥物的方法[11]。動物模型雖然對藥物作用產(chǎn)生完整生理反應(yīng)，卻無法用于對ASMC的收縮狀態(tài)的直接測量[12-13]。組織切片法保留了體內(nèi)的部分真實結(jié)構(gòu)，可用于直接觀測ASMC的收縮狀態(tài)。但是，源自動物的組織無法真實反映藥物對人體組織的作用[14]。2D體外細胞培養(yǎng)技術(shù)可以培養(yǎng)人源平滑肌細胞，但由于缺少可能調(diào)節(jié)平滑肌力學(xué)響應(yīng)的胞外基質(zhì)，無法較好地模擬體內(nèi)的生化和物理環(huán)境[15-16]。因此，通過3D細胞培養(yǎng)構(gòu)建微組織部分模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)更具優(yōu)勢[14]。這些培養(yǎng)在小培養(yǎng)皿中的微組織由細胞和基質(zhì)(如膠原蛋白、纖連蛋白等)共同構(gòu)成[17-23]。遺憾的是人們僅能從其收縮面積的變化來間接判斷藥物的作用，無法獲得平滑肌的力學(xué)測量數(shù)據(jù)[16]。因此，如何準確地測量藥物處理前后微組織的收縮力仍是一個挑戰(zhàn)。

本研究設(shè)計并制備了一種基于PDMS微結(jié)構(gòu)的細胞力學(xué)傳感器，利用3D細胞培養(yǎng)在其表面構(gòu)建ASMC微組織。實驗表明，培養(yǎng)在PDMS微結(jié)構(gòu)上的ASMC和膠原混合物能自發(fā)較快地收縮，48h后形成力學(xué)穩(wěn)定的微組織。通過測量微弦的彈性系數(shù)和間距可以計算出ASMC微組織的收縮力。對微組織進行藥物處理并測量了微組織的收縮和舒張力的變化，結(jié)果顯示，該檢測裝置具有較高的靈敏度和可靠性。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

Sylgard 184(美國Dow Corning公司)；三氯(1H,1H,2H,2H—全氟辛基)硅烷(美國Sigma公司)；聚乙烯醇(PVA)、組胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鼠尾I型膠原(美國Advanced Biomatrix公司)；杜氏改良培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶(美國gibco公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司)；細胞松弛素D(美國Sigma 公司)；硅脂(美國Baysilone公司)；鹽酸異丙腎上腺素(ISO)(上海源葉生物科技有限公司)。

CO2細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；生物安全柜(BSC-1300ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；超級純水儀(Milli Q Plus，Integral 10，美國Millipore公司)；倒置顯微鏡(Primo Vert)、倒置熒光顯微鏡(cell observer)、激光共聚焦顯微鏡(LSM 710)(德國Zeiss公司)；體視顯微鏡(S8APO，德國Leica公司；等離子清洗機(Potentlube PT-5S，深圳三和波達機電科技有限公司)。

2.2 方法

2.2.1PDMS微弦的制備 首先將Sylgard 184和交聯(lián)劑以10:1 比例混合并澆筑在硅模具上，高溫固化后得到聚二甲基硅氧烷(PDMS)負模。再將PDMS負模表面涂布2%PVA的脫模劑。將PDMS預(yù)聚物加入負模的微槽內(nèi)80℃固化4 h(1∶10 PDMS)后，微槽兩端位置粘合兩個2 mm高的PDMS矩形支持塊。兩個支持塊通過等離子處理，鍵合于一個14 mm圓形蓋玻片上。將裝置浸泡在水中過夜后，剝離反模得到PDMS微弦結(jié)構(gòu)。最后將微弦裝置放置于24孔培養(yǎng)皿中備用。

2.2.2PDMS微絲彈性系數(shù)的測量 首先將待測微弦水平放置于精密天平上。利用微操懸臂上裝載的不銹鋼針頭對微弦中央位置施加垂直載荷。以20 μm為步進距離，分別記錄微操懸臂下降距離和相應(yīng)的天平讀數(shù)。通過重力加速度常數(shù)將質(zhì)量(mg)轉(zhuǎn)換為力(mN)，得到微弦載荷-形變曲線，其斜率即為微弦的彈性系數(shù)(k)。

2.2.3細胞培養(yǎng)和藥物處理 本研究采用參考文獻[6]原代提取的大鼠氣道平滑肌細胞(8-10代)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。I型膠原蛋白首先經(jīng)pH中性調(diào)解后，再與一定數(shù)量的細胞混合，得到終濃度為106個細胞/mL和2 mg/mL膠原蛋白的混合物。4℃條件下，將細胞膠原混合物(6 μL)滴加于微弦中央位置，37℃培養(yǎng)箱30 min固化后，再向培養(yǎng)板孔中加入1 mL培養(yǎng)基，然后置于培養(yǎng)箱或顯微鏡下進行長期成像。

為進行藥物處理實驗，微組織培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基并孵育12 h。藥物梯度實驗時，每40 min由低到高依次向培養(yǎng)孔中加入100 μL含藥物的預(yù)熱培養(yǎng)。

2.2.4微組織的相差與熒光成像 倒置熒光顯微鏡的多點成像載物臺可同時對24孔板內(nèi)的多個微組織目標進行長時自動成像。顯微鏡的環(huán)境維持系統(tǒng)可維持37℃，5%CO2濃度的細胞培養(yǎng)環(huán)境。使用5×/0.16NA物鏡和ORCA-Flash4.0相機(日本濱松)進行相差成像(30 min/幀)。

采用Calcein-AM/ PI雙染色試劑盒檢測微組織內(nèi)細胞存活。藥物處理后，微組織經(jīng)2 M Calcein-AM和1 μM PI在黑暗中孵育15 min。更換為新鮮培養(yǎng)基后，用Zeiss 710 共聚焦顯微鏡于20×/0.5NA物鏡下分別在綠色(488 nm)和紅色(570 nm)通道對微組織成像。

2.2.5細胞收縮和舒張力的計算及圖像分析 使用Image J測量兩微弦中間位置之間的像素距離并根據(jù)相機的參像素數(shù)換算為距離單位。微組織的力(F)根據(jù)微弦位移距離(D)和彈性系數(shù)(k)計算：F=kD。微組織內(nèi)細胞的矢量遷移分析通過ImageJ中的粒子圖像測速(PIV)插件進行分析，并得到相對應(yīng)的圖像。使用GraphPad Prism 6進行t檢驗，P<0.05即認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PDMS微弦的表征

本研究采用PDMS微弦結(jié)構(gòu)作為細胞的應(yīng)力傳感器。我們首先對由模具灌注成型的微弦進行了形態(tài)和力學(xué)表征。

由圖1(a)可知，掃描電鏡圖像顯示微弦表面光滑，平行且均勻。測量不同批次制備的結(jié)構(gòu)的寬度、間距和高度，結(jié)果表明不同批次的微絲尺寸無顯著性差異，見圖1(b)。PDMS聚合物是良好的彈性材料，微米尺度的PDMS結(jié)構(gòu)可在微牛級作用力下發(fā)生形變。微弦擾度變化與受力載荷呈線性關(guān)系，見圖1(c)。因此，根據(jù)胡克定律，我們計算得出該PDMS微弦結(jié)構(gòu)的彈性系數(shù)為0.05 μN/μm。

圖1 PDMS微弦的表征

3.2 微組織的形成及其收縮力測量

當細胞-膠原混合物加載到微弦中央部位后，膠原在37℃環(huán)境中固化。隨培養(yǎng)時間延長，該混合物在細胞的作用下持續(xù)收縮成一個橢球狀微組織，見圖2(a)。我們利用粒子圖像測速分析方法來跟蹤微組織內(nèi)細胞的運動軌跡，發(fā)現(xiàn)微組織周邊的細胞比中央部分的細胞的遷移速度更快，其速度在第10 h達到最高，超過0.5 μm/min，見圖2(b)。

微組織的收縮導(dǎo)致2根微弦的間距逐漸減小。根據(jù)測量的微弦間距和其彈性系數(shù)，計算得出該過程中微組織的收縮力的變化。由圖2(c)可知，密度為106個細胞/mL的微組織經(jīng)30h培養(yǎng)后，其收縮力區(qū)域穩(wěn)定，并達到約9 μN。但微組織含有較低密度的細胞時(105個細胞/mL)，其收縮力顯著下降，最高值約為2 μN。為測量較為明顯的舒張作用，本研究將采用含高密度細胞的微組織進行藥物實驗。

圖2 ASMC微組織在PDMS微結(jié)構(gòu)上

3.3 藥物誘導(dǎo)微組織在PDMS微結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化

為模擬哮喘中ASMC的異常收縮態(tài)，本研究利用組胺來刺激微組織收縮。由圖3(a)可知，與未經(jīng)組胺處理的對照組相比，微組織經(jīng)100μM組胺處理30min后的收縮力增大了8倍。隨后，本研究通過細胞松弛素D解除肌動蛋白細胞骨架張力來確定ASMC微組織的可舒張的范圍。10 μM細胞松弛素 D處理30 min可大幅削弱ASMC的收縮力，見圖3(b)。該結(jié)果證明在微結(jié)構(gòu)上構(gòu)建的微組織可以測量0.04～0.20 μN間的力學(xué)變化。為評測該測量范圍內(nèi)舒張藥物的效果，本研究使用臨床藥物ISO來處理微結(jié)構(gòu)上的ASMC微組織。由圖3(c)可知，處于收縮態(tài)的微組織(組胺處理組)對1μM ISO更為敏感。而對照組在100 μM ISO處理時才產(chǎn)生較大幅度的舒張。進一步的實驗表明，兩組樣品均在500 μM ISO處理時產(chǎn)生最大舒張力。通過對藥物處理后微組織進行細胞存活檢測，我們發(fā)現(xiàn)高濃度ISO處理并未導(dǎo)致細胞死亡,見圖3(d)，證明其舒張作用不是由于細胞死亡引發(fā)。值得注意的是，當藥物濃度進一步增大到2 mM后，其舒張作用削弱，見圖3(c)。高濃度ISO舒張作用下降的機制還有待進一步研究。

圖3 ASMC微組織用于梯度加舒張藥物實驗

4 討論

本研究設(shè)計并制備了一種簡單的細胞力學(xué)測量裝置，并在其上面成功地構(gòu)建了細胞微組織。利用PDMS微結(jié)構(gòu)檢測出臨床藥物ISO的有效濃度范圍，當ISO藥物濃度達到2 mM以上，其促舒張作用下降，提示用藥濃度不能過高。本研究還發(fā)現(xiàn)模擬哮喘中處于收縮態(tài)的平滑肌微組織對ISO更為敏感，說明ISO對哮喘中的平滑肌細胞具有一定的特異性舒張作用。綜上，本研究建立的檢測細胞力學(xué)和藥物評測的方法，能實時定量檢測到藥物導(dǎo)致的細胞收縮力的變化，可靈敏、方便地篩選出抗哮喘藥物。