鄭群 ,狄海萍, 周超，姜彥△

(1.常州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，常州 213164；2. 鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷科，鄭州 450004；3. 常州大學(xué)藥學(xué)院 醫(yī)學(xué)院(籌)，常州 213164)

1 引 言

聚離子液體不僅具有離子液體的特殊性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性，高離子導(dǎo)電率以及高化學(xué)穩(wěn)定性[1-4]等，還兼具聚合物的一些性質(zhì)，如可加工性[5- 6]，較高的機械強度[7]以及較好的柔韌性[8]。因此，它在很多領(lǐng)域都有應(yīng)用，比如精細化工的催化方面[9-10]，電化學(xué)領(lǐng)域[11-13]，天然產(chǎn)物的分離方面[14]，生物醫(yī)用領(lǐng)域[15]等。

咪唑鹽類聚離子液體不僅具有高效的抗菌性能和較高的生物相容性[16]，而且不產(chǎn)生耐藥性，因此，受到國內(nèi)外科研人員的關(guān)注[17]。其抗菌機理在于聚合物所攜帶的咪唑鹽陽離子通過靜電作用吸附在帶負電的細菌細胞壁上，而后通過其疏水性鏈段擾亂細胞膜，破壞菌體的完整性，達到滅殺細菌的效果[18]。Smith等[19]探究了可在水中降解的硫代咪唑鎓鹽類聚離子液體抗菌劑，該聚合物可以有效滅殺細菌，且能夠在堿性條件下降解。嚴鋒等[20]采用n—溴—1—烷基醇和1—乙烯基咪唑合成了溴代3— (1—羥烷基) —1—乙烯基咪唑(IL—Cn—OH)，并制備了相應(yīng)的聚合物膜，該研究表明制備的聚離子液體膜材料具有良好的生物相容性以及抗菌性能。

目前大多數(shù)咪唑鹽類聚離子液體采用鹵素作為陰離子，而鹵素在生物體內(nèi)富集，長時間使用會對細胞造成潛在的傷害，因此限制了咪唑鹽類聚離子液體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[21-22]。為了降低鹵素陰離子的負面影響，本研究選用不同羧基作為咪唑鹽類聚離子液體的陰離子，通過采用“醛-胺”縮聚“一鍋法”[23-24]反應(yīng)制備了五種不同側(cè)鏈長度的羧酸鹽類咪唑鹽類聚離子液體，該法較之于傳統(tǒng)的制備方法更加簡單快捷，且效率更高。通過上述方法研究了不同側(cè)鏈長度的羧基對聚離子液體抗菌性能和細胞毒性的影響。

2 實驗部分

2.1 原料

乙二醛(40%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；甲醛(40%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司);1,4-丁二胺(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙酸(AR，上海申博化工有限公司)；丙酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；正丁酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；正戊酸(GC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；正己酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氫氧化鈉(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；去離子水；透析袋(MWCO=1 KD，光譜醫(yī)學(xué)，美國)；MH、LB和YPD培養(yǎng)基(索萊寶公司，美國)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)。

2.2 實驗儀器

傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET IS 10，Thermo Fisher SCIENTIFIC，美國)；核磁共振波譜儀(AVANCE II 500M，Bruker，德國)；激光粒度儀(ZEN 3600， Malvern Instruments Ltd，英國)；酶標儀(Infinite F50，Tecan，瑞士)。

2.3 樣品制備

乙酸鹽咪唑聚離子液體的合成：取1,4—丁二胺(1.98 g，0.0225 mol)溶于11.25 mL的去離子水中，在冰浴環(huán)境下將乙酸(2.6 mL，0.045 mol)滴加到上述丁二胺的水溶液中。滴加完成后，往溶液中先加入乙二醛(2.97 mL，0.0225 mol)，溶液呈現(xiàn)金黃色，再加入甲醛溶液(1.58 mL，0.0225 mol)，滴加完成后，加熱升溫至100 ℃，升溫過程中溶液顏色逐漸加深，最后轉(zhuǎn)變成黑色。升溫完成后使用NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的PH值至7左右。反應(yīng)36 h。全程在攪拌狀態(tài)下進行。反應(yīng)完成后采用透析袋(MWCO：1 KD， Spectra/Por?6，美國)透析18 h左右，透析完成后-80 ℃冷凍干燥(2.5 L 冷凍干燥系統(tǒng)，LABCONCO，美國)處理。

采用類似方式制備了丙酸鹽咪唑聚離子液體，丁酸鹽咪唑聚離子液體，戊酸鹽咪唑聚離子液體，己酸鹽咪唑聚離子液體。合成路線見圖1。

圖1 (a). 聚丁基咪唑乙酸鹽的合成；(b). 聚丁基咪唑丙酸鹽的合成；(c).聚丁基咪唑丁酸鹽的合成；(d). 聚丁基咪唑戊酸鹽的合成；(e). 聚丁基咪唑己酸鹽的合成

2.4 結(jié)構(gòu)表征與性能測試

2.4.1紅外光譜(FT-IR)測試 采用壓片法進行檢測，取少量樣品混合在溴化鉀粉末中，壓制成片，使用傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET IS 10，Thermo Fisher SCIENTIFIC，美國)進行測定，其分辨率為4 cm-1，掃描16次，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

2.4.2核磁共振 (1HNMR)測試 將少量純化的樣品充分溶于D2O中，采用核磁共振波譜儀(AVANCE II 500M，Bruker，德國)進行1HNMR的檢測。

2.4.3Zeta電位測試 將五種聚離子液體分別溶于PBS配制成0.036 g/mL的溶液，再分別將這五種溶液稀釋10倍與100倍，得到三組樣品溶液，對這三組樣品采用激光粒度儀(ZEN 3600， Malvern Instruments Ltd，英國)進行Zeta電位測試。

2.4.4粒徑分布的測試 將五種聚離子液體用PBS緩沖液稀釋至0.036，0.0036，0.00036 g/mL ,利用激光粒度儀(ZEN 3600， Malvern Instruments Ltd，英國)分別測定五種聚離子液體的平均粒徑。

2.4.5最小抑菌濃度(MIC)測試 MIC是指能使細菌的發(fā)育受到阻滯并被觀察到的抗細菌藥物的最小濃度。MIC在診斷實驗室里是抗細菌藥物對細菌抵抗力的一個重要的指標[25]。本研究采用酶標儀(Infinite F50，Tecan，瑞士)測試了五種不同的咪唑鹽類聚離子液體的最小抑菌濃度，先將三種菌液分別加入三種培養(yǎng)基中，大腸桿菌加入LB培養(yǎng)基(105CFU/mL)，金黃色葡萄球菌加入MH培養(yǎng)基(105CFU/mL)，白念球菌加入YPG培養(yǎng)基(105CFU/mL)，放入臺式恒溫振蕩器中，在37 ℃，200 r/h的條件下?lián)u勻16～18 h，得到所需的菌液培養(yǎng)基。隨后分別取三個96孔板，編號為1號、2號和3號，先在3個孔板的每個孔中分別加入LB液體培養(yǎng)基，MH液體培養(yǎng)基以及YPD液體培養(yǎng)基各100 μL，在第1行分別加入500 μg/mL的單體溶液，采用二倍稀釋法依次稀釋，然后在三個孔板的每個孔中分別加入100 μL大腸桿菌懸液，金黃色葡萄球菌懸液以及白念球菌懸液，混勻后(各行抗菌劑質(zhì)量濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL)放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h。隨后用酶標儀(Infinite F50，Tecan，瑞士)測量三個孔板上各孔的OD值，見式(1)，殺菌率公式通過與初始濃度值的比較，計算得出聚離子液體對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌以及白念球菌的最小抑菌濃度。

(1)

2.4.6細胞毒性測試 首先，將五種聚離子液體(聚丁基咪唑乙酸鹽、聚丁基咪唑丙酸鹽、聚丁基咪唑丁酸鹽、聚丁基咪唑戊酸鹽)溶于PBS中配置成13.5 mg/mL的溶液。其次，取上述五種配好的溶液(100 μL)加入96孔板中，與100 μL人皮膚成纖維細胞懸浮液(5×104cells/mL)混合，并在37 ℃，5% CO2氣氛中孵育24～48 h，并以100 μL的1×PBS為空白對照；接著，向上述混合溶液中加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)1 h；然后使用酶標儀(Infinite F50，Tecan，瑞士)測量450 nm處的OD值。細胞存活率見式(2)：

(2)

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜分析

由圖2可知，所制備的五種咪唑鹽類聚離子液體在1 564 cm-1處為咪唑環(huán)的伸縮振動峰，在1 160 cm-1出現(xiàn)的C=O的伸縮振動，和在3 427 cm-1出現(xiàn)的較寬的—OH的伸縮振動表明羧酸咪唑鹽類聚離子液體被成功制備出來。圖2(b)—(e)在2 967 cm-1處亞甲基吸收峰的強度逐漸增強是由于不同鏈長的羧酸陰離子與咪唑聚離子液體成鹽，羧酸的鏈長越長，吸收峰的強度越高。

圖2 (a).聚丁基咪唑乙酸鹽的紅外光譜；(b).聚丁基咪唑丙酸鹽的紅外光譜；(c).聚丁基咪唑丁酸鹽的紅外光譜；(d).聚丁基咪唑戊酸鹽的紅外光譜；(e).聚丁基咪唑己酸鹽的紅外光譜

3.2 核磁波譜分析

五種聚離子液體的1HNMR譜圖見圖3，在化學(xué)位移0.74 ppm處為側(cè)鏈所接的羧酸末端甲基上的質(zhì)子特征峰峰，1.0～2.0 ppm為與羧酸相鄰的亞甲基質(zhì)子特征峰，4.1 ppm以及1.4 ppm是烷基主鏈上的亞甲基吸收峰，7.4 ppm為咪唑環(huán)上的兩個質(zhì)子特征峰，由于亞甲基的數(shù)量不同，因此會有更多以及面積更大的峰出現(xiàn)。譜圖上峰的位置和面積與結(jié)構(gòu)式中氫的位置和數(shù)量相互對應(yīng)。證明不同的羧酸成功接枝到了含有咪唑環(huán)的烷基鏈上。

圖3 (a).聚丁基咪唑乙酸鹽的核磁氫譜；(b).聚丁基咪唑丙酸鹽的核磁氫譜；(c).聚丁基咪唑丁酸鹽的核磁氫譜；(d).聚丁基咪唑戊酸鹽的核磁氫譜；(e).聚丁基咪唑己酸鹽的核磁氫譜

3.3 Zeta potential電位和平均粒徑分析

采用ZEN 3600型激光粒度儀對五種聚離子液體進行了Zeta電位和平均粒徑的分析，測試結(jié)果見圖4。由粒徑分析圖中可以看出，所制備的羧基咪唑鹽聚離子液體粒徑分布較均勻，而且隨著接入羧酸鏈烷基數(shù)目的增加，其粒徑也逐漸增大。而由圖4(b)可知，聚離子液體所帶的正電荷也隨著粒徑的增大而增強。

圖4 五種聚離子液體的平均粒徑分析和zeta電位(a). 平均粒徑; (b). zeta電位Fig. 4 Zeta potential and analysis of average particle size of five poly(ionic liquids) (a) .average particle size; (b) .zeta potential

3.4 最小抑菌濃度測試

五種聚離子液體的最小抑菌值，見表1。從表中數(shù)據(jù)可以看到，聚丁基咪唑戊酸鹽和聚丁基咪唑己酸鹽的三種細菌的最小抑菌濃度普遍低于其余幾種聚離子液體。這是由于，一方面隨著聚離子液體正電荷的密度的增加，通過電荷吸引細菌的數(shù)量也在增加；另一方面，隨著羧基鏈上烷基數(shù)目的增加，疏水鏈段增加，破壞細菌細胞壁的概率增加。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)同一種聚離子液體對于白念球菌的抑菌效果要低于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，這是因為白念球菌相對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌繁殖力更強。

表1 五種聚離子液體的最小抑菌濃度測試

圖5為通過OD值，并根據(jù)殺菌率公式所得出的五種聚離子液體分別對三種細菌的殺菌率，圖中可以定量地看出五種聚離子液體對三種不同細菌的抑制效果，圖5(a)隨著聚合物濃度的升高，五種聚離子液體對大腸桿菌的殺菌率逐漸升高，其中聚丁基咪唑戊酸鹽和聚丁基咪唑己酸鹽的殺菌效果最好，它們在濃度較低的情況下對大腸桿菌的滅殺率已經(jīng)達到了90%左右，而其余三種聚離子液體也能在后續(xù)濃度增加的情況下達到90%左右的殺菌率。由圖5(b)可知，隨著聚合物濃度的提高，五種聚離子液體對于金黃色葡萄球菌的抑制率也逐漸提升，最終達到了90%左右，并且對金黃色葡萄球菌的抗菌率要明顯高于對大腸桿菌的抗菌率。圖5(c)表明了五種聚離子液體對白念球菌的殺菌率，分子量較低的聚離子液體對白念球菌的滅殺率不太明顯，在較高濃度時仍然沒有很好的殺菌效果。

圖5 (a).對大腸桿菌的抗菌率；(b).對金黃色葡萄球球菌的抗菌率；(c).對白念球菌的抗菌率

3.5 細胞毒性測試

通過對五種聚離子液體的細胞毒性測試，觀察它們在抗菌方面的效果，細胞存活率見圖6。隨著接入羧酸的分子量不斷增大，細胞的存活率呈現(xiàn)下降趨勢。雖然細胞毒性逐漸增大，但細胞存活率的下降趨勢較為緩慢，總體成纖維細胞的存活率要高于80%。 表明五種抗菌劑對細胞活性的影響不大，在生物醫(yī)用方面有著良好的用途。

圖6 五種聚離子液體的細胞毒性

4 結(jié)論

本研究以1，4—丁二胺，乙二醛，甲醛，乙酸，丙酸，正丁酸，正戊酸，正己酸為原料，采用“一鍋法”制備出了五種含不同側(cè)鏈的羧酸咪唑鹽類聚離子液體，并通過紅外光譜和核磁共振氫譜分析表征了其結(jié)構(gòu)特征，而后對它們的抗菌性能進行了測試。隨著羧基鏈上烷基數(shù)目的不斷增加，所制備的羧酸咪唑鹽類聚離子液體的抗菌性能逐漸提高，而細胞毒性雖然也呈上升趨勢，但總體上對于細胞的存活率影響不大，可作為一種新型聚合物抗菌劑應(yīng)用于生物醫(yī)用材料中。