王應(yīng)杰，侯粵峰，王麗君，沈步云，付 濤△

(1.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室，西安 710049；2.廣東誠輝醫(yī)療科技股份有限公司，江門 529200；3.朝日集團有限公司，香港 999077)

1 引 言

抗菌金屬材料在日常生活、生物醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用背景[1-4]。在不銹鋼、鈦等金屬材料中添加銀、銅等合金元素，可以得到抗菌金屬材料[1,4-7]。銀是一種有效的廣譜抗菌劑，但它存在潛在的生物毒性和環(huán)境安全性問題，而且銀是貴金屬，成本較高。相比之下，銅作為人體必需的一種微量元素，具有抗菌性能優(yōu)良、生物相容性好、成本低廉等優(yōu)點[6,8]。銅可以誘發(fā)細菌細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞其細胞膜的完整性；銅與細胞蛋白質(zhì)結(jié)合使蛋白質(zhì)失活，影響其發(fā)揮生理功能，從而起到殺菌作用。但是，銀和銅的硬度較低、耐磨性差[9]，把銅與CrN[10-11]、TiN[12]、類金剛石碳等硬質(zhì)薄膜復(fù)合，可以得到兼具良好抗菌性能和力學(xué)強度的表面改性層，并且抗菌劑的添加量遠少于塊體材料，在日常生活、醫(yī)院環(huán)境以及手術(shù)醫(yī)療器械、外科植入體等方面有良好的應(yīng)用前景[3,13]。

鉻是工業(yè)和醫(yī)用不銹鋼中含量最高的合金元素，其氮化物具有很高的硬度、耐磨性和耐蝕性。氮化鉻涂層是提高不銹鋼表面性能的一種有效方法。文獻[10-11]報道了含銅CrN薄膜的結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和抗菌性能，但是缺乏對膜層潤濕性和模擬環(huán)境條件下抗菌性能的報道。研究表明，材料的抗菌性能不僅取決于其化學(xué)成分，也與顯微結(jié)構(gòu)、表面特性、環(huán)境條件等因素有關(guān)[14-16]。有研究者開發(fā)了模擬呼吸、說話、咳嗽、打噴嚏、汗液接觸等條件的抗菌實驗方法[15-18]。液滴的干燥過程還受材料成分、潤濕性、環(huán)境條件等因素的影響[19]。因此，本研究采用磁控濺射技術(shù)制備了不同銅含量的CrNCu薄膜，并研究了膜層結(jié)構(gòu)、潤濕性、液滴干燥特性、抗菌活性和模擬環(huán)境條件下的抗菌性能。

2 實驗

采用反應(yīng)磁控濺射方法在載玻片上制備CrNCu薄膜。對基體進行脫脂、超聲清洗和壓縮氮氣吹干處理。離子濺射清洗后開始沉積薄膜，鍍膜期間通入氬氣和氮氣，通過OEM控制氣體流量，氣壓2.3 mTorr，鉻靶電流4 A，銅靶電流0～2 A(見表1)，基體偏壓-60 V，沉積時間15～30 min。濺射清洗和鍍膜時樣品架的轉(zhuǎn)速均是10 rpm。同時，制備了純銅薄膜作為參照試樣。

采用CS-210精密色差計測量鍍膜試樣的(L,a,b)值，采用臺階輪廓儀測量各試樣的膜厚和表面粗糙度。采用X射線衍射(XRD)分析膜層的晶體結(jié)構(gòu)，采用掃描電鏡(SEM)觀察試樣的表面形貌，電子能譜(EDX)分析表面元素組成。分別測量水和乙二醇在試樣表面的接觸角，計算表面能，包括極性分量和色散分量[20-21]。在試樣表面滴加一滴1～5 μL的純水，用噴壺在試樣表面噴霧一層水膜，顯微鏡下觀察水滴和水膜的干燥過程。

采用平板計數(shù)法評價試樣對大腸桿菌的抗菌性能。大腸桿菌是導(dǎo)致感染的一種革蘭氏陰性致病菌。實驗前對所需的器具進行蒸汽滅菌，對試樣采用75%乙醇滅菌和紫外照射滅菌。取10 μL濃度為105CFU/mL的細菌懸液滴加到試樣表面，迅速用無菌濾膜覆蓋試樣表面，室溫和潮濕條件下作用3 h后把試樣和濾膜一起放入細菌培養(yǎng)管，加入3 mL無菌水，充分震蕩洗滌后，吸取適量洗滌液移至已成型的LB固態(tài)培養(yǎng)基上，涂布均勻。把接種的培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，并拍照計數(shù)。

另外，采用噴霧菌液-平板計數(shù)法評價試樣對大腸桿菌的抗菌性能。實驗前對所需的器具和試樣進行滅菌。取濃度為103CFU/mL的細菌培養(yǎng)液置于噴壺中，搖勻后在試樣表面均勻噴霧，把樣品放置在20°C培養(yǎng)箱中分別作用15、30和60 min后，進行平板培養(yǎng)和拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 膜層結(jié)構(gòu)和成分分析

外觀觀察發(fā)現(xiàn)，膜層在玻璃基體上結(jié)合牢固，表面平滑。色差計測得涂層試樣的亮度L值為59～67，低于不銹鋼(L=77)。膜層的沉積速率隨銅靶電流增大而升高，但表面粗糙度在0.9～1.4 nm(見表1)。薄膜試樣的SEM形貌見圖1。試樣G00-G08表面由規(guī)則的晶粒組成，而試樣G12-G20表面由無特征的胞狀顆粒組成。EDX面分析表明，隨著銅靶電流的升高，膜層中的銅含量逐漸升高，而Cr和N含量下降，Cr/N原子比在2.6～3.8(見表1)。

圖1 CrNCu薄膜的SEM表面形貌

表1 CrNCu試樣的銅靶電流、膜厚、沉積速率、粗糙度和元素原子比

在XRD譜(見圖2)中，試樣G00出現(xiàn)面心立方CrN(111)的強衍射峰和CrN(200)、(220)以及金屬Cr的弱衍射峰。隨著銅靶電流的增大，CrN和Cr的衍射峰減弱，銅的衍射峰增強，試樣G20的CrN(200)、Cr(110)和Cu(111)的峰融合為一個峰。研究表明，銅與Cr-N相的互溶性較差，可形成納米復(fù)合結(jié)構(gòu)[10,22]。根據(jù)以上XRD和EDX分析，當前薄膜由CrN、Cr和Cu組成。

圖2 CrNCu試樣的XRD圖譜

3.2 接觸角、表面能和水滴、水膜干燥過程

潤濕性和表面能會影響材料的抗菌性能及細胞行為[23-24]。CrNCu薄膜試樣的水接觸角為100.3～105.2°，而銅膜試樣的接觸角為121.7°，見圖3(a)。因此，各試樣都是疏水性的。CrNCu薄膜試樣的乙二醇接觸角也較高(80.6～85.2°)。據(jù)報道，氣相沉積CrN薄膜具有較低的表面能[25-26]。試樣G00—G20和銅膜的表面能在14.4～22.2 mJ/cm2，以色散分量為主，總值遠低于玻璃試樣55.9 mJ/cm2，見圖3(b)。低表面能的疏水性表面有利于材料的防污和抗菌應(yīng)用[23-24]。

圖3 CrNCu試樣的接觸角和表面能

實驗結(jié)果表明，在相同的溫濕度條件下，1～5 μL水滴的干燥時間隨水滴體積增加而延長。觀察2 μL水滴和菌液在試樣表面的干燥過程，從俯視圖及側(cè)視圖可以看出，液滴隨時間延長而逐漸蒸發(fā)，菌液干燥后留下一個由培養(yǎng)基和細菌組成的白斑，見圖4；水滴和菌液在同一試樣上的干燥時間相同。由于試樣G00—G20的表面能較低、界面張力較小，其水滴總表面積相對較小，因此，完全干燥的時間為20～22 min，長于玻璃試樣的干燥時間17 min，見圖5(a)。隨著環(huán)境濕度升高，水滴的干燥時間也逐漸延長，見圖5(b)。

圖4 玻璃和CrNCu試樣上2 μL水滴和菌液在干燥過程中的典型俯視圖像

在試樣表面噴霧一層水膜，以模擬打噴嚏和咳嗽時材料表面多個液滴的干燥過程?？梢钥闯?，玻璃試樣的親水性較高，形成的水珠直徑較大；薄膜試樣的疏水性較高，形成了很多細小的水滴，見圖6。薄膜試樣上水滴的干燥時間也長于玻璃試樣，這與單個水滴的研究結(jié)果一致，見圖5(a)。因此，在打噴嚏和咳嗽情況下，材料表面液滴的干燥時間不僅受到環(huán)境溫濕度影響，也受到材料表面潤濕性[15,19]、液滴尺寸及其均勻性的影響。

圖5 玻璃和CrNCu試樣表面2 μL水滴和噴霧水膜在相同和不同濕度條件下的干燥時間

圖6 玻璃和CrNCu試樣表面噴霧水膜在干燥過程中的典型俯視圖像

3.3 抗菌性能

在玻璃和薄膜試樣表面滴加10 μL大腸桿菌菌液，覆蓋濾膜，作用3 h后進行平板計數(shù)，結(jié)果見圖7。玻璃對照和試樣G00觀察到大量菌落，試樣G04只有幾個菌落，而試樣G08未觀察到菌落。在菌液與材料的作用過程中，薄膜表面的銅離子向菌液擴散，從而產(chǎn)生了抗菌作用。

圖7 CrNCu試樣平板計數(shù)法的抗菌測試結(jié)果

另外，在試樣表面噴霧一層菌液以模擬材料在打噴嚏、咳嗽情況下的抗菌性能。結(jié)果表明，在保持潤濕的條件下，玻璃試樣表面有較多大腸桿菌存活，而試樣G08在作用60 min后表面的細菌數(shù)量明顯減少(見圖8)。在敞口的環(huán)境條件下，作用15 min時兩種試樣表面已經(jīng)干燥，但仍有少量細菌存活，而在30 min時無細菌存活。因此，大腸桿菌在培養(yǎng)液干燥后仍能存活一段時間，而含銅薄膜G08對大腸桿菌有較強的抗菌作用。

圖8 玻璃和試樣G08噴霧菌液和潮濕條件下作用不同時間后的平板計數(shù)法抗菌測試結(jié)果

4 結(jié)論

隨著銅靶電流的增大，CrNCu薄膜的沉積速率和銅含量升高，CrN和Cr的含量下降，但粗糙度在0.9～1.4 nm。CrNCu薄膜具有高疏水性和低表面能，其表面水滴的干燥時間長于玻璃試樣。CrNCu薄膜對大腸桿菌具有較好的抗菌性能，可望用于環(huán)境設(shè)施及醫(yī)療器械的抗菌表面改性。