王郅琪,趙云燕,孫 建,梁俊超,顏廷獻(xiàn),危文亮,樂美旺*

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所/江西省油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家油料改良中心 南昌分中心,江西 南昌 330200)

芝麻(SesamumindicumL.)屬胡麻科胡麻屬,是擁有2000多年種植歷史的世界上最古老的油料作物之一[1-2],其富含油脂、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。我國(guó)芝麻種植分布廣泛,種類繁多,按不同種皮顏色可將芝麻分為白芝麻、黑芝麻、黃芝麻、褐芝麻、淺褐芝麻、灰芝麻等,其中白芝麻和黑芝麻是種植面積和種植種類最多的兩種芝麻。黑芝麻含有豐富的維生素E、A、B1、B2和礦物質(zhì)[4],其常量元素鉀、鈣、鎂含量與白芝麻相比高出20%～40%,微量元素鐵、鋅、銅含量與白芝麻相比高出20%～50%,與生殖功能有關(guān)的錳元素含量是白芝麻的14倍,超微量元素硒含量與白芝麻相比高出15%[5]。此外,與其它粒色芝麻相比,黑芝麻含有天然的黑色素,其食用價(jià)值較大,因此受到越來越多人的青睞[6]。江西位于長(zhǎng)江中下游南岸的華東地區(qū),是繼河南、湖北、安徽之后中國(guó)第四大芝麻主產(chǎn)地,以黑芝麻為主要種植類型,種植面積和產(chǎn)量均占中國(guó)的60%以上,是中國(guó)唯一的黑芝麻商品基地[7]。

近年來,關(guān)于中國(guó)芝麻種質(zhì)資源鑒定和新選育品種評(píng)價(jià)的研究較多[8],例如：崔彥琴等[9]利用聚類分析等統(tǒng)計(jì)方法對(duì)河北省收集的300份芝麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析；呂偉等[10]基于18個(gè)表型性狀對(duì)189份山西芝麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析；韓俊酶等[11]利用SPSS軟件對(duì)200份山西種質(zhì)資源的13個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行了遺傳多樣性分析；俞信英等[12〗基于82個(gè)表型性狀對(duì)浙江省沿海地區(qū)19份芝麻地方種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。同時(shí),SRAP[13-17]、SSR[17-21]等DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于作物遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)[22-24]的研究也有較多的報(bào)道。但對(duì)于黑芝麻種質(zhì)的研究較少,只有孫建等[13]利用SRAP和SSR引物對(duì)20個(gè)中國(guó)主要黑芝麻品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析;車卓等[15]利用SRAP引物組合對(duì)100份黑芝麻核心種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。本研究基于“第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動(dòng)”收集的74份江西黑芝麻地方種質(zhì),對(duì)這些種質(zhì)表型性狀的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,并結(jié)合SRAP和SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了分子水平的遺傳多樣性分析,以期為拓寬優(yōu)異的黑芝麻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為“全國(guó)第三次資源普查與收集行動(dòng)”所收集的74份江西省黑芝麻地方種質(zhì)資源,來自九江、南昌、上饒、景德鎮(zhèn)、鷹潭、宜春、萍鄉(xiāng)、新余、撫州、吉安、贛州等11個(gè)地市的31個(gè)縣(市、區(qū)),種質(zhì)信息詳見表1。

表1 74份江西省黑芝麻地方種質(zhì)資源的情況

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年6月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所試驗(yàn)田基地(南昌橫崗)進(jìn)行。采取順序區(qū)組設(shè)計(jì),每份種質(zhì)種植4行,行長(zhǎng)1.6 m,行距0.40 m,株距0.15 m。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 表型性狀的鑒定 根據(jù)《芝麻種質(zhì)資源描述規(guī)范化和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化》[25]的描述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)株高、始蒴高度、空稍尖長(zhǎng)度、蒴果長(zhǎng)度、蒴果寬度、蒴果厚度、每蒴粒數(shù)、千粒重、蛋白含量、含油量等10個(gè)表型性狀進(jìn)行觀察記載。每份種質(zhì)選取10個(gè)典型單株，進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì),并利用近紅外分析儀測(cè)定含油量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè) DNA提取和質(zhì)量檢測(cè)參照孫建等[21]的方法,取飽滿芝麻種子發(fā)芽后的鮮嫩葉片,采用CTAB法提取DNA,對(duì)殘留的RNA用RNaseA消除；用紫外分光核酸測(cè)定儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量,最后將DNA稀釋到50 ng/μL,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR引物與PCR擴(kuò)增

根據(jù)已經(jīng)公開發(fā)表的文獻(xiàn)資料,從83對(duì)SSR中篩選出28對(duì)條帶清晰且差異明顯的引物(表2),由上海生工生物工程股份有限公司(Sangon)合成。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的SSR-PCR反應(yīng)體系(10 μL):50 ng/μL DNA 2 μL、10 μmol/μL正反向引物各0.6 μL、2×Master Mix(包含Taq酶、Mg2+和dNTPs)5 μL,加ddH2O至10 μL。SSR-PCR反應(yīng)程序:94 ℃變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,12 ℃保存。對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離和銀染顯影。

表2 SSR引物及其序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

在銀染顯影后,統(tǒng)計(jì)清晰且在同一位點(diǎn)的SSR擴(kuò)增條帶,記為“1”,無帶記為“0”。參照Nei等[30]的方法,采用NTSYS-PC 2.10e分析軟件對(duì)SSR數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)進(jìn)行計(jì)算,然后采用非加權(quán)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析;其他數(shù)據(jù)分析于Excel 2010上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀的多樣性分析與聚類分析

2.1.1 表型多樣性分析 由表3可以看出,總體黑芝麻的10個(gè)表型性狀的變異系數(shù)范圍在8.56%～40.64%,其中變異系數(shù)最大的為空稍尖長(zhǎng)度(40.64%),最小的為蒴果長(zhǎng)(8.56%),從大到小依次為空稍尖長(zhǎng)度(40.64%)>始蒴高度(24.94%)>每蒴粒數(shù)(22.11%)>蒴果厚(17.22%)>株高(13.45%)>千粒重(13.14%)>蛋白質(zhì)含量(11.36%)>蒴果寬(10.90%)>含油量(8.79%)>蒴果長(zhǎng)(8.56%)。遺傳多樣性指數(shù)范圍在1.4071～2.0453,其中表現(xiàn)最大的為蒴果長(zhǎng)(2.0453),表現(xiàn)最小的為蒴果厚(1.4071),從大到小依次為蒴果長(zhǎng)(2.0453)>株高(2.0213)>千粒重(2.0119)>含油量(1.9999)>空稍尖長(zhǎng)度(1.9806)>蛋白質(zhì)含量(1.9085)>始蒴高度(1.8654)>每蒴粒數(shù)(1.7506)>蒴果寬(1.6686)>蒴果厚(1.4071)。

表3 黑芝麻表型性狀的遺傳多樣性指數(shù)和變異系數(shù)

根據(jù)江西省黑芝麻主要分布在環(huán)鄱陽(yáng)湖區(qū)域的特點(diǎn),將74份黑芝麻種質(zhì)的種植區(qū)域劃分為主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū),其中主產(chǎn)區(qū)包括九江市、上饒市、景德鎮(zhèn)市、南昌市、鷹潭市等5個(gè)區(qū)域,非主產(chǎn)區(qū)包括宜春市、萍鄉(xiāng)市、新余市、撫州市、吉安市、贛州市等6個(gè)區(qū)域。在74份黑芝麻種質(zhì)資源中,主產(chǎn)區(qū)的黑芝麻種質(zhì)占50份,非主產(chǎn)區(qū)的黑芝麻種質(zhì)占24份。對(duì)主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū)的10個(gè)表型性狀的變異范圍、變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示：主產(chǎn)區(qū)與非主產(chǎn)區(qū)的變異范圍相差較小;除了空稍尖長(zhǎng)度和蛋白質(zhì)含量這兩個(gè)表型性狀外,非主產(chǎn)區(qū)中包括株高等其余8個(gè)表型性狀的變異系數(shù)均大于主產(chǎn)區(qū)的,這可能與非主產(chǎn)區(qū)所在地理位置、種質(zhì)種植面積及種質(zhì)間流通較少有關(guān)；主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)的株高、始蒴高度、蒴果長(zhǎng)度、千粒重、蛋白質(zhì)含量和含油量這6個(gè)表型性狀的遺傳多樣性比非主產(chǎn)區(qū)略高,而非主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)的空稍尖長(zhǎng)度、蒴果寬、蒴果厚和每蒴粒數(shù)這4個(gè)性狀的遺傳多樣性高于主產(chǎn)區(qū)的。

2.1.2 表型性狀的相關(guān)性分析 對(duì)74份江西黑芝麻地方種質(zhì)資源的10個(gè)表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果(表4)表明:株高與始蒴高度、千粒重呈極顯著正相關(guān),與含油量呈極顯著負(fù)相關(guān),與蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān);始蒴高度與含油量呈極顯著負(fù)相關(guān);空稍尖長(zhǎng)度與含油量呈極顯著正相關(guān);蒴果長(zhǎng)與千粒重呈極顯著正相關(guān);蒴果寬與蒴果厚、每蒴粒數(shù)呈極顯著正相關(guān);蒴果厚與每蒴粒數(shù)呈極顯著正相關(guān);每蒴粒數(shù)與千粒重、含油量呈極顯著負(fù)相關(guān);蛋白質(zhì)含量與含油量呈極顯著負(fù)相關(guān)。由此可見:江西黑芝麻種質(zhì)資源10個(gè)性狀之間相互影響較大,同一性狀與多個(gè)性狀呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān),說明芝麻各個(gè)表型性狀間是互相影響和制約的。

表4 江西黑芝麻地方種質(zhì)資源表型性狀間的相關(guān)系數(shù)

2.1.3 聚類分析 采用歐式距離Ward聚類法對(duì)74份江西黑芝麻地方種質(zhì)資源的10個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類分析,將供試種質(zhì)分為4類(圖1);根據(jù)聚類結(jié)果,進(jìn)一步對(duì)4個(gè)類群黑芝麻地方種質(zhì)的表型值進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表5所示。

圖1 江西黑芝麻地方種質(zhì)資源基于10個(gè)表型性狀的聚類圖

表5 不同類群黑芝麻地方種質(zhì)的10個(gè)表型性狀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

類群Ⅰ包含19份材料,該類群的特點(diǎn)表現(xiàn)為株高最矮,始蒴高度最低,空稍尖長(zhǎng)度最長(zhǎng),蒴果長(zhǎng)度較長(zhǎng),蒴果寬度最窄,蒴果厚度最薄,每蒴粒數(shù)最少,千粒重適中,蛋白質(zhì)含量最低,含油量最高,此類材料屬于矮稈高油型種質(zhì)資源。類群Ⅱ包含24份材料,該類群的特點(diǎn)表現(xiàn)為空稍尖長(zhǎng)度較長(zhǎng),蒴果寬度較窄,蒴果厚度較薄,每蒴粒數(shù)較少,千粒重較大,蛋白質(zhì)含量較高,含油量較高,株高、始蒴高度、蒴果長(zhǎng)度適中,此類材料屬高油高蛋白的優(yōu)異種質(zhì),綜合性狀較好。類群Ⅲ包含15份材料,該類群的特點(diǎn)表現(xiàn)為蒴果長(zhǎng)度最短,蒴果寬度最寬,蒴果厚度最厚,每蒴粒數(shù)最多,千粒重最小,蛋白質(zhì)含量最低,含油量較低,株高、始蒴高度和空稍尖長(zhǎng)度均適中,此類材料屬于每蒴多粒特異種質(zhì)。類群Ⅳ包含16份材料,該類群的特點(diǎn)表現(xiàn)為株高最高,始蒴高度最高,空稍尖長(zhǎng)度最短,蒴果長(zhǎng)度最長(zhǎng),蒴果寬度較窄,蒴果厚度較薄,每蒴粒數(shù)適中,千粒重最大,蛋白質(zhì)含量最高,含油量最低,此類材料屬于高稈高蛋白的特異種質(zhì)。

2.2 基于SSR的遺傳多樣性分析

2.2.1 多態(tài)性分析 28對(duì)多態(tài)性SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果(表6)顯示：共獲得了265個(gè)DNA條帶,每對(duì)引物擴(kuò)增5～21條,平均9.46條；其中多態(tài)性條帶222條,多態(tài)性比率為83.77%；每對(duì)引物擴(kuò)增出2～21條多態(tài)性帶,平均7.93條。

表6 SSR引物擴(kuò)增的結(jié)果

2.2.2 總體遺傳多樣性分析與聚類分析 由表7可見：74份黑芝麻地方種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)在0.3901～0.9238,平均0.7042；遺傳距離在0.0896～0.9870,平均0.3521。結(jié)合遺傳距離和遺傳相似系數(shù)來看,遺傳差異最小的是九江市永修縣的兩個(gè)黑芝麻種質(zhì)(GS=0.9238,GD=0.0896),遺傳差異最大的是九江市永修縣的黑芝麻種質(zhì)與上饒市鄱陽(yáng)縣的種質(zhì)(GS=0.3901,GD=0.9870)?？梢?江西黑芝麻種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變幅較大,遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn),表明江西省芝麻地方種質(zhì)的遺傳多樣性豐富,遺傳基礎(chǔ)廣泛。

對(duì)74份黑芝麻地方種質(zhì)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果(圖2)表明,74份種質(zhì)總體被分為4大類群。類群Ⅰ共有52份種質(zhì),占總種質(zhì)數(shù)的70.27%,表現(xiàn)為各個(gè)種質(zhì)交叉混合聚集;類群Ⅱ包括10份種質(zhì),其中屬于主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū)的黑芝麻種質(zhì)分別占40%和60%,表現(xiàn)為親緣關(guān)系與地域距離無明顯關(guān)聯(lián)；類群Ⅲ和類群Ⅳ均僅有1份種質(zhì),分別屬于主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū)的黑芝麻種質(zhì)。類群Ⅰ包含的種質(zhì)最多,將其進(jìn)一步劃分為8個(gè)類別(A～H類，如圖2所示),其中A類有28份種質(zhì),包括主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū)的黑芝麻種質(zhì);B類有14份種質(zhì),均為主產(chǎn)區(qū)的黑芝麻種質(zhì)。

圖2 基于SSR的74份江西黑芝麻地方種質(zhì)資源的聚類圖

2.2.3 主產(chǎn)區(qū)與非主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)間的多樣性比較 對(duì)江西省主產(chǎn)區(qū)和非主產(chǎn)區(qū)74份黑芝麻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離進(jìn)行比較分析,結(jié)果(表7)表明：非主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)范圍(0.5112～0.8879)與主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)(0.3901～0.9238)相比略小,且其平均值(0.7088)也略小于主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)平均值(0.7138);非主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)的遺傳距離平均值與主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)相比略遠(yuǎn)?？梢?非主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)的遺傳多樣性較主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)要豐富,其遺傳基礎(chǔ)更廣泛。這與兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的表型性狀遺傳多樣性分析結(jié)果基本一致。

表7 74份黑芝麻地方種質(zhì)資源的總體遺傳多樣性和不同產(chǎn)區(qū)遺傳多樣性比較

3 結(jié)論和討論

根據(jù)表型性狀的遺傳多樣性分析和聚類分析,明確種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)和特異種質(zhì)分類的特點(diǎn),有助于育種研究。同時(shí)利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法從基因水平上分析種質(zhì)多樣性和分類,將表型鑒定和分子鑒定結(jié)合起來，可以充分挖掘芝麻種質(zhì)資源的豐富基因。本研究對(duì)74份江西黑芝麻地方種質(zhì)資源進(jìn)行了主要表型性狀及基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析和聚類分析。10個(gè)表型性狀的變異系數(shù)為8.56%～40.64%,除了蒴果長(zhǎng)和含油量外,其余8個(gè)性狀的變異系數(shù)均大于10%,這與呂偉等[31]研究認(rèn)為變異系數(shù)大于10%則種質(zhì)間差異較大的結(jié)果一致,表明供試種質(zhì)資源的遺傳變異相對(duì)豐富,這為篩選特異種質(zhì)資源和拓寬我國(guó)黑芝麻遺傳育種范圍提供了重要的種質(zhì)來源。非主產(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)資源的表型性狀及分子標(biāo)記的遺傳多樣性與主產(chǎn)區(qū)相比均表現(xiàn)為較豐富,這可能因?yàn)橹鳟a(chǎn)區(qū)黑芝麻種質(zhì)地處江西省鄱陽(yáng)湖流域,種質(zhì)互相頻繁流通,商品種覆蓋度較高,導(dǎo)致多樣性的豐富度相對(duì)略差,遺傳相似系數(shù)略高。

SSR分子標(biāo)記自身的序列在不同物種中的長(zhǎng)度、重復(fù)單位次數(shù)和在染色體上的分布存在差異,因此其具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高等諸多特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于作物群體分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定及輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位等研究[32-36]。在本研究中，28對(duì)SSR引物每對(duì)擴(kuò)增5～21條DNA帶,其中2～21條為多態(tài)性帶,多態(tài)性比例達(dá)83.77%,與前人利用SSR標(biāo)記分析芝麻種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果和多態(tài)性比率[35,37]相符。由此表明,本研究篩選所得的SSR引物能準(zhǔn)確地反映引物在種質(zhì)間的遺傳差異。不同來源芝麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)存在一定差異。本研究中74份黑芝麻種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.3901～0.9238,遺傳距離為0.0896～0.9870,存在一定的遺傳多樣性,且相對(duì)豐富,這與車卓等[15]對(duì)100份黑芝麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性的研究結(jié)果相符。

本研究將表型鑒定和分子標(biāo)記鑒定相結(jié)合，對(duì)74份江西黑芝麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析和聚類分析,結(jié)果表明,供試種質(zhì)存在較豐富的遺傳多樣性,且非主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)的遺傳多樣性與主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)相比更豐富。同時(shí),發(fā)現(xiàn)黑芝麻種質(zhì)間的親緣關(guān)系與種質(zhì)資源產(chǎn)區(qū)間的分布距離無直接關(guān)聯(lián),且篩選獲得了不同表型性狀特異的種質(zhì)資源。