李小雙，太顥然，蘇炳銀△，李淑蓉

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都 610500)

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是世界第二大神經(jīng)退行性疾病[1]，其病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性，出現(xiàn)靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、平衡障礙等[2]。研究[3]認(rèn)為，PD是由多種風(fēng)險(xiǎn)和致病因素(遺傳和環(huán)境因素)導(dǎo)致的多因素疾病。目前PD治療手段單一，傳統(tǒng)的替代治療雖可一定程度減輕癥狀，但需長(zhǎng)期甚至終生用藥。長(zhǎng)期藥物治療易誘發(fā)神經(jīng)、消化、心血管系統(tǒng)等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響PD患者生活質(zhì)量。

線粒體絲氨酸蛋白酶(high temperature requirement A2，HtrA2/Omi)正常情況下定位在線粒體雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)之間，通過(guò)折疊錯(cuò)誤、剪切和清除變性蛋白，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定；在線粒體受損和通透性增加的情況下，HtrA2/Omi能夠被釋放到細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依賴性和非依賴性機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞死亡[4-5]。HtrA2/Omi在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的保護(hù)作用，HtrA2/Omi失活的mnd2小鼠和HtrA2/Omi敲除小鼠表現(xiàn)出黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元丟失和PD樣癥狀[6-7]。在部分PD患者中，檢測(cè)到HtrA2/Omi突變[8]。HtrA2/Omi激活還受PD相關(guān)激酶PINK1介導(dǎo)的HtrA2/Omi磷酸化的調(diào)控[9]。此外，PD的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[10--11]。有研究[12]證明，HtrA2/Omi參與了細(xì)胞的應(yīng)激過(guò)程，發(fā)揮了細(xì)胞保護(hù)作用。研究[13]表明，過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi的細(xì)胞在對(duì)過(guò)氧化氫應(yīng)激時(shí)可增強(qiáng)細(xì)胞抵抗。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)的代謝產(chǎn)物1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridin-1-iuM iodide，MPP+)通過(guò)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元的線粒體中，導(dǎo)致線粒體功能障礙使多巴胺能神經(jīng)元丟失[14]，多巴胺能神經(jīng)元的丟失或變性是PD的主要病理改變，因此，MPTP常被用于PD的動(dòng)物模型構(gòu)建。為進(jìn)一步驗(yàn)證HtrA2/Omi的體內(nèi)效應(yīng)，本研究通過(guò)腹腔注射MPTP構(gòu)建PD小鼠模型[15-16]，尾靜脈注射腺相關(guān)病毒AAV9-HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi，觀察過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi的小鼠體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)，探索過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi小鼠在MPTP誘導(dǎo)下PD模型小鼠中多巴胺能神經(jīng)元的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12月齡雄性C57BL小鼠16只，體重(32.0±1.8)g，隨機(jī)分為生理鹽水組(5只)、MPTP組(5只)和MPTP+HtrA2/Omi組(6只)。動(dòng)物飼養(yǎng)采用清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，每周更換1次墊料、飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理與操作均嚴(yán)格按照國(guó)際衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)的倫理指南進(jìn)行，通過(guò)成都醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在麻醉下進(jìn)行，以減少其疼痛。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 MPTP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，GAPDH(ab8245)多克隆抗體、HtrA2/Omi(ab75982)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)(25085)、α突觸核蛋白(AB5038)購(gòu)自德國(guó)Merck公司，AAV9-HtrA2/Omi(48262-1)腺相關(guān)病毒(每只5×108vg/L)，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液購(gòu)自江蘇碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 MPTP+HtrA2/Omi組小鼠注射AAV9-HtrA2/Omi腺病毒載體，注射前使用滅菌后PBS稀釋病毒，每只小鼠注射病毒量約2×108vg/L，注射后觀察0.5 h。在注射病毒2周后，MPTP組和MPTP+HtrA2/Omi組小鼠按每只20 mg/kg腹腔注射MPTP，構(gòu)建PD小鼠模型，生理鹽水組用等量生理鹽水作為對(duì)照，1次/d，連續(xù)注射2周。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè) HtrA2/Omi注射2周后，對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和爬桿實(shí)驗(yàn)。1)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：在MPTP注射前3 d，對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，計(jì)時(shí)1 min，轉(zhuǎn)棒速度從0開始逐步加速到30 r/min，記錄小鼠在棒時(shí)間(s)，每次結(jié)束后休息1 min，重復(fù)訓(xùn)練5次。每次記錄前1 d按上述方法訓(xùn)練小鼠，每隔1周記錄1次，每次記錄在同一時(shí)間段進(jìn)行，連續(xù)記錄3次。2)爬桿實(shí)驗(yàn)：將直徑為2 cm塑料小球固定于1根長(zhǎng)60 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏繞2層紗布，防止打滑。使小鼠四爪接觸木桿頂端，松手，開始計(jì)時(shí)，記錄小鼠從頂端滑到底部的時(shí)間(s)，每次記錄在同一時(shí)間段進(jìn)行，連續(xù)記錄3次。

1.2.3 小鼠腦組織綠色熒光檢測(cè) MPTP+HtrA2/Omi組小鼠在尾靜脈注射腺相關(guān)病毒AAV9-HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi 4周后，取3組小鼠腦組織，進(jìn)行固定、脫水、包埋、冰凍切片，干燥箱37 ℃烘片1 h，烘干后PBS洗3次，每次10 min，含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，在BX-63正置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)。

1.2.4 小鼠組織免疫熒光檢測(cè) 用4% PFA灌注，取小鼠腦組織進(jìn)行固定、脫水、包埋、冰凍切片。選3組小鼠同一層面的中腦組織切片，干燥箱37 ℃烘片1 h，烘干后PBS洗3次，10 min/次，在電磁爐中用改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，煮沸20 min，自然冷卻至室溫，PBS洗3次，用950 μL PBS、50 μL馬血清、5 μL 0.5% TritonX-100配制的封閉液，4 ℃封閉1 h，一抗工作液4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，10 min/次，常溫下二抗避光孵育2 h，PBS洗3次，10 min/次，含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察。

1.2.5 組織蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 用新加入1%PMSF的RIPA裂解液裂解新鮮組織收集蛋白樣品，用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度，取20 μg蛋白加入適量的1× SDS-PAGE上樣緩沖液，加入10%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。垂直電泳溴酚藍(lán)燃料到達(dá)底部后，50 V恒壓冰浴轉(zhuǎn)膜2 h，用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline tween-20，PBST)室溫封閉1 h，PBST漂洗10 min，一抗稀釋液稀釋的一抗工作液4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，10 min/次，常溫下二抗孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min/次。電化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)按A液∶B液=1∶1配制，滴于PVDF膜上，成像顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為功能檢測(cè)

生理鹽水組、MPTP組和MPTP+HtrA2/Omi組間小鼠在棒時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著MPTP注射時(shí)間的增加，MPTP組小鼠在棒時(shí)間逐漸縮短，表明持續(xù)腹腔注射MPTP導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)行為功能障礙。MPTP+HtrA2/Omi組0周時(shí)小鼠在棒時(shí)間明顯低于生理鹽水組和MPTP組；隨著MPTP注射時(shí)間延長(zhǎng)，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠在棒時(shí)間逐漸增加，第2周時(shí)，生理鹽水組小鼠在棒時(shí)間高于MPTP組，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠在棒時(shí)間高于MPTP組，表明HtrA2/Omi的表達(dá)可改善小鼠因MPTP導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力減退(表1)。

表1 3組小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

C57BL雄性小鼠在開始注射MPTP藥物時(shí)，生理鹽水組和MPTP組小鼠爬桿時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著MPTP注射時(shí)間的延長(zhǎng)，MPTP組小鼠爬桿時(shí)間較生理鹽水組小鼠縮短(P<0.05)；而在MPTP+HtrA2/Omi組小鼠中，持續(xù)MPTP注射后小鼠爬桿時(shí)間先出現(xiàn)短暫下降后又出現(xiàn)增加，表明HtrA2/Omi可改善小鼠因MPTP導(dǎo)致的行為能力障礙(表2)。

表2 3組小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 小鼠腦組織GFP表達(dá)

3組小鼠腦組織GFP結(jié)果顯示，生理鹽水組和MPTP組未檢測(cè)到GFP，MPTP+HtrA2/Omi組中觀察到GFP熒光，表明小鼠在注射腺相關(guān)病毒AAV9-HtrA2/Omi第4周后，HtrA2/Omi在小鼠腦組織中成功表達(dá)(圖1)。

圖1 3組小鼠中腦組織GFP表達(dá)

2.3 過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi對(duì)MPTP所致中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的作用

3組小鼠在腹腔注射MPTP 2周后，檢測(cè)各組同一層面的腦組織切片TH免疫熒光，MPTP組小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元TH陽(yáng)性細(xì)胞較生理鹽水組小鼠明顯減少，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于MPTP組，但少于生理鹽水組。對(duì)3組中腦組織蛋白免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MPTP可使TH蛋白表達(dá)量減少，而過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi后，可減輕MPTP導(dǎo)致的TH蛋白減少，表明過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi后，可減緩MPTP導(dǎo)致的小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的減少，緩解因MPTP導(dǎo)致的TH蛋白表達(dá)的減少(圖2、表3～4)。

圖2 3組小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元檢測(cè)

表3 3組小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元TH陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光結(jié)果(個(gè)，

表4 3組小鼠中腦組織TH與GAPDH灰度值比值結(jié)果

2.4 過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi對(duì)α突觸核蛋白的作用

用免疫熒光檢測(cè)3組小鼠腦組織同一層面切片中α突觸核蛋白聚集情況顯示，MPTP組小鼠中腦α突觸核蛋白聚集多于生理鹽水組，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠中腦α突觸核蛋白聚集少于MPTP組，但多于生理鹽水組。在長(zhǎng)時(shí)間MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中，小鼠中腦α突觸核蛋白聚集增多，MPTP+HtrA2/Omi組小鼠α突觸核蛋白比MPTP組減少，表明過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi可減輕MPTP所致中腦α突觸核蛋白聚集(圖3、表5)。

圖3 3組小鼠中腦組織α突觸核蛋白免疫熒光

表5 3組小鼠中腦組織α突觸核蛋白免疫熒光結(jié)果(個(gè),

3 討論

PD是僅次于阿爾茨海默病的世界第二大神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于老年人，隨著年齡增加其發(fā)病率成倍增加[1,17]。PD起病隱匿，早期較難診斷，對(duì)于緩慢進(jìn)展者則可表現(xiàn)出靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌張力升高等表現(xiàn)，臨床較易診斷。目前以左旋多巴、抗膽堿能藥物、金剛烷胺等多巴胺前體等替代治療作為PD的首選治療。PD患者需長(zhǎng)期乃至終生服藥，而長(zhǎng)期用藥容易造成神經(jīng)、消化、心血管系統(tǒng)等不良反應(yīng)[18-19]。很多口服藥物難以通過(guò)血腦屏障，因此PD治療很難獲得理想療效，因而探索潛在的治療途徑和靶點(diǎn)，對(duì)PD患者治療疾病、改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量有重要意義。研究[20-21]表明，HtrA2/Omi突變可能與PD等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，在HtrA2/Omi活性缺失的mnd2小鼠中，可出現(xiàn)神經(jīng)退行性改變。為驗(yàn)證HtrA2/Omi在PD中的效應(yīng)，利用腺相關(guān)病毒AAV9-HtrA2/Omi構(gòu)建HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)小鼠；同時(shí)以MPTP腹腔注射構(gòu)建小鼠PD模型，觀察HtrA2/Omi對(duì)PD中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響，旨在發(fā)現(xiàn)潛在的臨床治療思路。

本研究結(jié)果表明，HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)后小鼠未出現(xiàn)明顯異常情況，通過(guò)檢測(cè)AAV9-HtrA2/Omi熒光，提示HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)模型構(gòu)建成功。在MPTP腹腔注射構(gòu)建PD小鼠模型時(shí)，小鼠未出現(xiàn)死亡，但在MPTP注射后小鼠出現(xiàn)行為能力減弱，進(jìn)一步比較生理鹽水組、MPTP組、MPTP+HtrA2/Omi組MPTP注射2周后的情況，發(fā)現(xiàn)HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)小鼠在活動(dòng)能力(爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn))方面較MPTP組有一定改善。在對(duì)3組同一位置層面的中腦多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行TH免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MPTP組出現(xiàn)TH陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少，而HtrA2/Omi的過(guò)表達(dá)減輕了中腦多巴胺能神經(jīng)元的大量丟失。α突觸核蛋白在許多神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮重要作用，α突觸核蛋白是α突觸核蛋白聚合物的重要組分，是PD的病理特征之一。3組中腦多巴胺能神經(jīng)元染色細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，生理鹽水組與MPTP組、MPTP+HtrA2/Omi組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且MPTP組與MPTP+HtrA2/Omi組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明HtrA2/Omi過(guò)表達(dá)的小鼠可減緩因MPTP所致中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的大量丟失，起到神經(jīng)保護(hù)作用。3組小鼠腦組織α突觸核蛋白聚集檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組α突觸核蛋白聚集明顯低于MPTP組、MPTP+HtrA2/Omi組，且過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi的小鼠中，α突觸核蛋白聚集少于MPTP組，對(duì)3次不同重復(fù)試驗(yàn)相同面積腦組織α突觸核蛋白免疫印跡點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)也發(fā)現(xiàn)，3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且MPTP組與MPTP+HtrA2/Omi組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi后可減少因MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中α突觸核蛋白的聚集[22-23]。

綜上所述，在MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠中，過(guò)表達(dá)HtrA2/Omi可減少中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失，減輕腦組織中α突觸核蛋白的聚集，可一定程度改善小鼠行為能力。