雷秀雯 李艷紅 黃松翠 李淑宇

洛陽市第五人民醫(yī)院 河南，洛陽 471000

抑郁癥是臨床常見的精神系統(tǒng)疾病，以情緒持續(xù)低落、興趣喪失及行為異常為主要表現(xiàn)。近年來隨著人們生活壓力的增加，抑郁癥發(fā)病率呈升高趨勢，已成為非衰老致殘或致死的主要疾病之一，對社會及患者家庭造成嚴重影響[1]。目前，臨床常采用氟西汀、奧氮平等非典型抗精神病藥物治療抑郁癥，但長期服用后，睡眠障礙、便秘等副作用較為明顯，且存在藥物依賴性強、易復(fù)發(fā)等缺點[2-3]。因此，亟需尋找安全有效的藥物治療抑郁癥。

中藥梔子具有廣泛的藥理學(xué)活性，是經(jīng)典抗抑郁中藥方劑梔子厚樸湯及越鞠丸的主要藥物[4]。羥異梔子苷（hydroxyisogeniposide，HGP）是從梔子干燥果實或根莖中提取的活性成分，是梔子發(fā)揮藥效的活性成分之一，具有抗氧化、神經(jīng)保護等多種藥理學(xué)作用[5]，但目前關(guān)于其對抑郁癥的影響及機制研究較少。鑒于此，本研究通過復(fù)制抑郁癥大鼠模型，觀察不同劑量HGP對抑郁癥大鼠抑郁行為及下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）軸的影響，探討其調(diào)控機制，以期為抑郁癥的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量180～220g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（京）2016-0011]，飼養(yǎng)于洛陽普萊柯生物工程股份有限公司[實驗動物使用許可證號碼：SCXK（豫）2018-0011]，環(huán)境溫度24～26℃、濕度40%～60%，明暗交替。動物自由飲水和進食，實驗操作符合減少、替代和優(yōu)化原則。

1.1.2 主要試劑和儀器 HGP（純度：98%；美國化學(xué)文摘服務(wù)社號：24512-62-7）購于西寶生物科技（上海）股份有限公司（批號：20200301）；鹽酸氟西汀膠囊購于法國Patheon France公司（國藥準字：J20170022；批號：20191211）；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質(zhì)酮 （corticosterone，CORT）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購于美國R&D公司（批號：BYS12106B、hz-EL-R0269c）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司（批號：T2210）；兔抗大鼠糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）、下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）多抗（一抗）及山羊抗兔GR、CRH單抗（二抗）均購于美國Abcam公司（批號：ab83461、ab77686、ab144525、ab236982）；電化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海羅氏制藥有限公司（批號：B3817）。

ERM3100型石蠟切片機購于上海京工實業(yè)有限公司；Multiskan Sky型全波長酶標儀為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，CheniDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠抑郁模型建立 各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激法復(fù)制抑郁癥模型[6]：以7種應(yīng)激源干預(yù)，包括擁擠鼠籠過夜、夾尾1min、束縛3h、4℃冰水游泳、45℃環(huán)境5min、160次·min-1水平振蕩30min和24h禁食禁水，每天1種，連續(xù)3周。以大鼠出現(xiàn)自主活動減少，對糖水興趣喪失、食欲不振等表現(xiàn)為建模成功。

1.2.2 分組及干預(yù) 將60只SD大鼠隨機分為對照組、抑郁組、HGP低、高劑量組和陽性藥組，各12只。除對照組外，其余各組采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激法復(fù)制抑郁癥大鼠模型，本研究所有大鼠均造模成功。參考文獻[7]，進行人與實驗動物用藥劑量換算，大鼠的臨床等效劑量為10mg·kg-1。對造模成功大鼠進行干預(yù)：HGP低、高劑量組分別予HGP臨床等效劑量（10mg·kg-1）和4倍臨床等效劑量（40mg·kg-1）灌胃，陽性藥物組予10mg·kg-1的鹽酸氟西汀灌胃，對照組和抑郁組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，各組均1次/d，持續(xù)給藥2周。

1.2.3 糖水偏好實驗 實驗開展前適應(yīng)性喂養(yǎng)糖水，末次給藥結(jié)束后，禁水12h，開始糖水偏好實驗。大鼠單籠飼養(yǎng)，同時放置含有2%蔗糖水和蒸餾水的瓶子，自由飲水12h，測定12h內(nèi)蔗糖水和蒸餾水消耗量，計算糖水消耗占比（%）=蔗糖水消耗量/（蔗糖水消耗量+蒸餾水消耗量）×100%。

1.2.4 曠場實驗 糖水實驗結(jié)束后開始曠場實驗，將大鼠置于實驗環(huán)境適應(yīng)30min后，放于96cm×96cm×50cm黑色敞箱（等分為16個方格）的正中央，觀察大鼠5min內(nèi)的運動軌跡，記錄大鼠中央格停留時間（除邊緣格之外的格均劃為中央格）、運動總格數(shù)（某一肢體越過格子數(shù)）、修飾（理毛）次數(shù)。每只大鼠實驗結(jié)束后，以乙醇擦拭箱底，清除殘留氣味。

1.2.5 血漿ACTH、CORT水平檢測 糖水偏愛及曠場實驗結(jié)束后，采用0.3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血5mL，置于抗凝管中，3 000r·min-1離心10min，離心半徑12cm，取上層血漿，采用ELISA試劑盒檢測ACTH、CORT水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟執(zhí)行，酶標儀檢測450nm波長處吸光度值，根據(jù)標準曲線計算ACTH、CORT水平。

1.2.6 海馬組織病理學(xué)觀察 各組大鼠采血結(jié)束后處死，立即取腦組織，分離左右海馬組織與下丘腦，左側(cè)海馬組織以4%多聚甲醛固定48h備用，右側(cè)海馬和下丘腦組織-80℃保存?zhèn)溆?。?%多聚甲醛固定的腦組織，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，二甲苯透明、梯度乙醇脫水后，以蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠固定，光鏡下觀察海馬組織病理學(xué)改變情況。

1.2.7 海馬區(qū)GR及下丘腦CRH mRNA表達檢測取-80℃保存的海馬和下丘腦組織，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為互補鏈脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）并以之為模板進行Real-time qPCR，嚴格按照試劑盒說明書操作。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參基因，采用2-△△CT計算目的基因的相對表達量。引物的設(shè)計與合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 海馬區(qū)GR及下丘腦CRH，蛋白表達檢測 取-80℃保存的海馬和下丘腦組織，液氮研磨后冰上裂解20min，12 000r·min-1離心20min，取上清液，沸水水浴10min，再次離心取上清液，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定總蛋白含量，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃搖床孵育過夜，加入1∶4 000稀釋的二抗，常溫孵育1.5h，加入電化學(xué)發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）-t檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對照組大鼠一般情況無異常，其余各組造模期間毛發(fā)無光澤，行為從易激惹逐漸轉(zhuǎn)為反應(yīng)遲鈍，喜臥少動，攝食量減少；HGP低、高劑量組和陽性藥組干預(yù)期間上述表現(xiàn)有所改善，其中HGP高劑量組和陽性藥組改善最為明顯。

2.2 各組大鼠糖水偏好實驗結(jié)果比較 各組間總體比較，糖水消耗占比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組糖水消耗占比均降低（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組糖水消耗占比均升高（P＜0.05），其中陽性藥組高于HGP高劑量組（P＜0.05），HGP高劑量組高于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠糖水消耗占比比較（±s）Tab.2 Comparison of the proportion of syrup consumption in each group（±s）

表2 各組大鼠糖水消耗占比比較（±s）Tab.2 Comparison of the proportion of syrup consumption in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05；與HGP高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05;compared with HGP high-dose group，▲P＜0.05

組別糖水消耗占比（%）對照組 87.61±6.10抑郁組 58.02±5.26*HGP 低劑量組 66.04±5.41*#HGP 高劑量組 71.38±5.91*#△陽性藥組 80.25±6.70*#△▲F值 37.568 P值 ＜0.001

2.3 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較 各組間總體比較，曠場實驗運動格數(shù)、修飾次數(shù)及中央格停留時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組運動格數(shù)、修飾次數(shù)均減少，中央格停留時間延長（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組運動格數(shù)、修飾次數(shù)均增多，其中陽性藥組多于HGP高劑量組，HGP高劑量組多于HGP低劑量組（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組中央格停留時間縮短，其中陽性藥組短于HGP高劑量組，HGP高劑量組短于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠曠場實驗行為比較（±s）Tab.3 Comparison of experimental behavior of open field experiment in each group（±s）

表3 各組大鼠曠場實驗行為比較（±s）Tab.3 Comparison of experimental behavior of open field experiment in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05；與HGP高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05;compared with HGP high-dose group，▲P＜0.05

組別 運動格數(shù)（格） 修飾次數(shù)（次） 中央格停留時間（s）對照組 59.10±7.03 6.22±0.95 1.95±0.70抑郁組 27.39±7.15* 3.16±0.87* 8.50±1.10*HGP 低劑量組 35.81±7.50*# 4.02±0.60*# 7.48±1.05*#HGP 高劑量組 48.62±8.34*#△ 4.65±0.58*#△ 5.36±1.12*#△陽性藥組 53.01±8.01*#△▲ 5.43±0.69*#△▲ 4.27±0.98*#△▲F值 28.078 25.070 70.790 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組大鼠血漿ACTH、CORT水平比較 各組間總體比較，血漿ACTH、CORT水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組血漿ACTH、CORT水平均升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組血漿ACTH、CORT水平均降低，其中HGP高劑量組和陽性藥組均低于HGP低劑量組（P＜0.05）；與陽性藥組比較，HGP高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表4。

表4 各組大鼠血漿ACTH、CORT水平比較（±s，ng·L-1）Tab.4 Comparison of plasma ACTH and CORT levels in each group（±s，ng·L-1）

表4 各組大鼠血漿ACTH、CORT水平比較（±s，ng·L-1）Tab.4 Comparison of plasma ACTH and CORT levels in each group（±s，ng·L-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05

組別ACTH CORT對照組 41.60±6.37 162.54±16.32抑郁組 67.11±6.22* 285.30±18.24*HGP 低劑量組 61.39±6.08*# 254.94±17.03*#HGP 高劑量組 50.26±6.16*#△ 225.48±14.50*#△陽性藥組 48.12±5.85*#△ 216.07±15.74*#△F值 28.936 221.866 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各組大鼠海馬CA3區(qū)病理組織學(xué)改變比較 對照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊；抑郁組神經(jīng)元排列雜亂疏松，細胞質(zhì)深染，細胞核固縮，部分空泡化，可見變性壞死細胞；HGP低、高劑量組和陽性藥組CA3區(qū)病變較抑郁組減輕，其中HGP高劑量組和陽性藥組減輕最為明顯，可見神經(jīng)元排列整齊，細胞膜和細胞核結(jié)構(gòu)較為完整。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA3區(qū)病理組織學(xué)觀察（HE染色，200×）Fig.1 Histopathological observation of hippocampal CA3 area in each group（HE staining，200×）

2.6 各組大鼠海馬區(qū)GR及下丘腦CRH mRNA表達比較 各組間總體比較，海馬區(qū)GR及下丘腦CRH mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與對照組比較，其余4組海馬區(qū)GR mRNA相對表達量均降低，下丘腦CRH mRNA相對表達量均升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組海馬區(qū)GR mRNA相對表達量均升高，其中陽性藥組高于HGP高劑量組，HGP高劑量組高于HGP低劑量組（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組下丘腦CRH mRNA相對表達量降低，其中陽性藥組低于HGP高劑量組，HGP高劑量組低于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見表5。

表5 各組大鼠海馬區(qū)GR及下丘腦CRH mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of mRNA expression of GR in hippocampus and CRH in hypothalamus（±s）

表5 各組大鼠海馬區(qū)GR及下丘腦CRH mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of mRNA expression of GR in hippocampus and CRH in hypothalamus（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與抑郁組比較，#P＜0.05；與HGP低劑量組比較，△P＜0.05；與HGP高劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with depression group，#P＜0.05;compared with HGP low-dose group，△P＜0.05;compared with HGP high-dose group，▲P＜0.05

組別GR CRH對照組 1.05±0.12 0.95±0.10抑郁組 0.16±0.03* 3.71±0.20*HGP 低劑量組 0.42±0.05*# 3.06±0.16*#HGP 高劑量組 0.78±0.06*#△ 2.13±0.15*#△陽性藥組 0.90±0.06*#△▲ 1.84±0.12*#△▲F值 56.417 124.587 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.7 各組大鼠海馬區(qū)GR及下丘腦CRH蛋白表達比較 各組間總體比較，海馬區(qū)GR及下丘腦CRH蛋白相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，其余4組海馬區(qū)GR蛋白相對表達量均降低，下丘腦CRH蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組海馬區(qū)GR蛋白相對表達量均升高，其中陽性藥組高于HGP高劑量組，HGP高劑量組高于HGP低劑量組（P＜0.05）；與抑郁組比較，HGP低、高劑量組和陽性藥組下丘腦CRH蛋白相對表達量降低，其中陽性藥組低于HGP高劑量組，HGP高劑量組低于HGP低劑量組（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)GR及下丘腦CRH蛋白表達比較Fig.2 Comparison of protein expression of GR in hippocampus and CRH in hypothalamus in each group

3 討論

抑郁癥屬于世界范圍的流行性精神疾病，全球發(fā)病率達4.7%，給社會造成了極大的醫(yī)療負擔[8]。臨床調(diào)查表明，抑郁癥的發(fā)病與生理因素、環(huán)境因素及遺傳因素等多種因素相互作用有關(guān)，但具體發(fā)病機制尚未明確[9-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)參與了抑郁癥的發(fā)生及發(fā)展，其中HPA軸功能失調(diào)是抑郁癥發(fā)生的主要機制之一[11]。目前，藥物治療仍是抑郁癥主要治療手段。據(jù)報道，長期服用西藥抗抑郁藥治療的患者中，約35%患者出現(xiàn)了藥物抵抗，治療效果不佳；此外，藥物副作用也影響了患者服藥依從性，進一步增加了治療難度[12]。

中醫(yī)藥從整體辨證治療精神系統(tǒng)疾病，具有療效確切、副作用少等多種優(yōu)勢[13-14]。梔子無毒，入肺、心、肝經(jīng)，是抗抑郁中藥方劑中的常用藥材。HGP是從梔子中提取的環(huán)醚萜類化合物，同時也是梔子發(fā)揮藥效的主要成分之一[15-16]。研究表明，HGP可有效改善慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁癥大鼠的抑郁和焦慮癥狀，證實其具有調(diào)整神經(jīng)行為學(xué)的作用[17]。Ma等[18]應(yīng)用梔子苷干預(yù)脂多糖誘導(dǎo)的類神經(jīng)細胞株P(guān)C12炎癥損傷模型，結(jié)果顯示梔子苷能夠降低PC12細胞培養(yǎng)上清液中的促炎因子水平，抑制PC12細胞凋亡。Yu等[19]研究顯示，HGP聯(lián)合臭氧可抑制坐骨神經(jīng)損傷大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，促進神經(jīng)細胞修復(fù)。上述研究均說明梔子苷具有神經(jīng)保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁組大鼠糖水消耗占比、運動格數(shù)、修飾次數(shù)較對照組減少，中央格停留時間延長，表現(xiàn)出空間探索能力不足、對自身關(guān)注程度降低等典型抑郁行為學(xué)特征[20]，HE染色顯示海馬CA3區(qū)出現(xiàn)病理損傷，出現(xiàn)神經(jīng)元細胞壞死的表現(xiàn)，提示抑郁癥大鼠模型復(fù)制成功；而采用不同劑量HGP干預(yù)后，大鼠抑郁行為學(xué)表現(xiàn)得到改善，海馬CA3區(qū)病理損傷減輕，且高劑量改善更為明顯，但陽性藥組改善程度仍優(yōu)于高劑量HGP，提示HGP可有效改善抑郁大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，抑制海馬神經(jīng)元損傷，但改善效果仍需進一步提高。

既往研究顯示，抑郁癥患者血清及腦脊液中HPA軸相關(guān)激素和受體表達呈異常升高趨勢，HPA軸表現(xiàn)為持續(xù)激活，伴有神經(jīng)內(nèi)分泌表現(xiàn)異常，ACTH和CORT過度分泌，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷[21-22]。抑郁狀態(tài)下血漿ACTH、CORT水平異常升高，且與抑郁程度呈正相關(guān)，抗抑郁治療后隨之下降[23]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)是與情緒調(diào)節(jié)和學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)，HPA軸各激素的水平受海馬區(qū)負反饋調(diào)節(jié)，分布于海馬區(qū)的Ⅱ型GR是主要調(diào)控分子，其表達水平對于HPA軸負反饋調(diào)節(jié)至關(guān)重要[24]。Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，青春期應(yīng)激所致抑郁雄鼠存在海馬GR表達下調(diào)現(xiàn)象，且其表達水平與抑郁樣行為有關(guān)。本研究結(jié)果提示，抑郁組大鼠海馬區(qū)GR mRNA和蛋白表達下調(diào)，下丘腦CRH mRNA和蛋白表達上調(diào)，說明抑郁癥大鼠存在HPA軸CRH功能亢進，而海馬GR負調(diào)控能力下降。采用不同劑量HGP干預(yù)后，大鼠海馬區(qū)GR mRNA和蛋白表達上調(diào)，下丘腦CRH mRNA和蛋白表達下調(diào)，且HGP不同劑量間比較，高劑量HGP調(diào)控能力更強，提示HGP可能通過調(diào)控HPA軸改善抑郁大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及抑制神經(jīng)系統(tǒng)損傷。本研究結(jié)果還顯示，高劑量HGP對HPA軸的調(diào)控能力弱于陽性藥鹽酸氟西汀，一方面可能與用藥劑量不足有關(guān)，另一方面，筆者推測除了對HPA軸的調(diào)控，HGP可能存在其他作用機制，需要進一步研究證實。

綜上所述，HGP可有效改善抑郁大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，其抗抑郁機制可能與調(diào)控HPA軸有關(guān)，本研究結(jié)果可為HGP用于抑郁癥的治療提供初步的理論依據(jù)。在進一步研究中，應(yīng)繼續(xù)深入探討HGP治療抑郁癥的作用機制，為臨床應(yīng)用提供更充足的理論支持。