張海蓮，陳曉，王玉團(tuán)

(1.菏澤市立醫(yī)院，山東 菏澤 274031；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101)

鹿角始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為鹿科動(dòng)物馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusNipponTemminck)已骨化的角，分別習(xí)稱馬鹿角和梅花鹿角，功能為溫腎陽，強(qiáng)筋骨，行血消腫[1-2]，臨床上主要用于治療人體腎陽虛衰之癥，因療效非常確切，故應(yīng)用廣泛。

目前對(duì)鹿角的研究主要集中在蛋白酶解工藝及蛋白和多肽藥理作用方面[3-4]，也有微量元素分析[5-7]、多糖測定[8]和氨基酸分析[9]等方面的研究報(bào)道，但對(duì)鹿角的生物活性成分蛋白質(zhì)組成方面的研究較少。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)鹿角中主要蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與種類確認(rèn)，可以明確鹿角的主要蛋白質(zhì)組成。試驗(yàn)中采用蛋白變性溶液對(duì)鹿角進(jìn)行處理，再用胰蛋白酶酶解，然后通過超高效液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行多肽分離及質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，最后選擇目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到鹿角中蛋白質(zhì)及多肽的信息[10]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀Ultimate 3000聯(lián)用Fusion-Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀(Thermo 公司)，XSE205電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料 Millipore 10 K超濾管；胰蛋白酶(Sigma公司，批號(hào)：SLBG6452V)；馬鹿角、梅花鹿角[安國藥材市場王兵要鹿茸鋪提供，產(chǎn)地為黑龍江省伊春市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)彭艷麗教授鑒定，分別為鹿科動(dòng)物馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)和梅花鹿(CervusNipponTemminck)已骨化的角，編號(hào)分別為DWY-MLJ-03和DWY-MHLJ-03]；鹽酸胍、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨均為分析純；甲酸、乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取鹿角粉碎成細(xì)粉(過五號(hào)篩)，精密稱取20 mg，加2 mL蛋白質(zhì)變性溶液(含6 mol·L-1鹽酸胍、1 mol·L-1Tris和2 mmol·L-1EDTA二鈉)，加0.05 mL的 0.5 mol·L-1DTT溶液，置于90 ℃保溫處理4 h，取出，放冷至室溫。加入0.12 mL的0.55 mol·L-1IAA溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液0.2 mL置于10 k超濾管中，反復(fù)離心洗滌，截留物加0.2 mL的1%碳酸氫銨溶液和5 μL胰蛋白酶溶液(10 mg· mL-1)，置于37 ℃酶解12 h，0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.2 超高效液相色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，3 μm)，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1，進(jìn)樣量為5 μL，流速0.3 mL·min-1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2.3 高分辨質(zhì)譜條件 采用Fusion-Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀，電噴霧離子源(ESI+)，噴霧電壓為3.5 kV，霧化溫度350 ℃，離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃，S-Lens傳輸效率設(shè)置為60%。一級(jí)質(zhì)譜采用Orbitrap作為質(zhì)量分析器，分辨率為120 000(m/z400)，采集范圍為350～1 550 Th，RFLens設(shè)為60%，Mass Tolerance設(shè)為10 ppm；二級(jí)質(zhì)譜采用離子阱作為質(zhì)量分析器，分辨率為30 000(m/z400)，F(xiàn)irst Mass(m/z)為100，采用Rapid Scan模式進(jìn)行掃描，HCD碎裂模式，碎裂能量設(shè)置為40%。

2.4 數(shù)據(jù)采集 按上述色譜和質(zhì)譜條件，對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析，總離子流圖見圖1。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法 目前沒有鹿角完整的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，為鑒定出盡可能多的蛋白質(zhì)，選擇Deer(鹿)以及Colleagn(膠原蛋白)和Keratin(角蛋白)組成的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫Deer+Colleagn+Keratin(截止到2019-03-21)。經(jīng)對(duì)該組合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，該庫含有鹿科所有動(dòng)物及近源動(dòng)物的已知蛋白，蛋白種類非常豐富，能滿足研究需要。利用蛋白質(zhì)解析軟件PEAKS Studio 8.5來處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，為鑒定出盡可能多的已知多肽，必須進(jìn)行合理的參數(shù)設(shè)置，軟件參數(shù)設(shè)置如下：-10lgP(Peptide)≥20、-10lgP(Protein)≥20、 FDR(Peptide-Spectrum Matches)=0.4%、Ascore(Post-translational modification of Peptide)≥0、Peptide mutation ion intensity≥0%、Proteins unique peptides≥0、ALC(De novo only)≥50%、FDR為0.4%，設(shè)定無論氨基酸是否修飾還是變異全部進(jìn)行檢測。

A.馬鹿角；B.梅花鹿角圖1 UPLC-HRMS鹿角總離子流圖

3 分析

3.1 總離子流圖(TIC)分析 由圖1可知，馬鹿角和梅花鹿角酶解后多肽的總離子流色譜圖相似度非常高，提示兩者具有相似的多肽組成。目標(biāo)多肽主要在保留時(shí)間75 min之前流出，75 min以后的色譜峰經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)，均為單電荷，為鹿角中非多肽有機(jī)物。

3.2 多肽種類及匹配情況的分析 根據(jù)表2結(jié)果可知，馬鹿角和梅花鹿角鑒定出的多肽種類分別為1 565和1 546種，說明兩者在相同酶解條件下得到的多肽種類數(shù)非常相近。共有多肽數(shù)占已匹配多肽數(shù)兩者均約為50%，扣除酶解過程中產(chǎn)生的不完全酶解多肽或異常斷裂形成的多肽，則馬鹿角和梅花鹿角90%以上的多肽是相同的，可見兩種鹿角多肽組成具有非常高的相似性，與總離子流圖分析結(jié)論相一致。

表2 多肽匹配結(jié)果

3.3 覆蓋度和相對(duì)含量top 10蛋白質(zhì)組成的分析 基于蛋白質(zhì)覆蓋度的高低可以明確目標(biāo)物中蛋白質(zhì)的組成。對(duì)組成目標(biāo)蛋白質(zhì)的各種多肽響應(yīng)值進(jìn)行累加，可以獲知目標(biāo)物中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。覆蓋度top 10的蛋白質(zhì)90%為Ⅰ型膠原蛋白，其中表3中馬鹿角編號(hào)1和梅花鹿角編號(hào)6蛋白質(zhì)均來自鹿的血液，原因是鹿角由真皮層形成，而真皮層富含血液。相對(duì)含量top 10的蛋白全部為Ⅰ型或Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)，且兩者70%的蛋白質(zhì)相同。

4 討論

由表3和表4可知，部分蛋白來自非鹿科動(dòng)物體，說明目前對(duì)鹿角的蛋白組成研究不充分，鹿角中很多蛋白沒有被發(fā)現(xiàn)鑒定，更進(jìn)一步說明本研究具有必要性。試驗(yàn)中曾嘗試僅用Deer蛋白庫，結(jié)果蛋白覆蓋度較低，top 10中蛋白有9個(gè)覆蓋度不足65%，鑒定出的蛋白種類較少。而采用Deer+Colleagn+Keratin組合庫，含量較高的蛋白均能進(jìn)行匹配，top 10中蛋白覆蓋度不低于90%，該結(jié)果更有利于分析鹿角中的未知蛋白。

表3 覆蓋度top 10的蛋白質(zhì)組成

表4 相對(duì)含量top 10的蛋白質(zhì)組成

鹿角及其炮制品(鹿角膠和鹿角霜)臨床用量非常大，但針對(duì)其生物活性成分膠原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究尚少，本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)馬鹿角和梅花鹿角進(jìn)行了分析，明確了組成梅花鹿角和馬鹿角的主要蛋白質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者所含蛋白質(zhì)主要為Ⅰ型膠原蛋白，并含少量Ⅱ型膠原蛋白，不含角蛋白。目前自然界存在的膠原蛋白種類有幾十種，其結(jié)構(gòu)和功能各不相同。Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)上的區(qū)別主要是含糖量的不同，Ⅰ型膠原蛋白的含糖量約為1%，而Ⅱ型可高達(dá)10%。Ⅰ型膠原蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展、以及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，Ⅱ型膠原蛋白能修復(fù)各種關(guān)節(jié)損傷，提示鹿角所具有的強(qiáng)筋骨的功能可能與其所含豐富的Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白密切相關(guān)。該研究可為進(jìn)一步開發(fā)利用鹿角蛋白質(zhì)提供有效的技術(shù)支持。該研究下一步將分離純化上述目標(biāo)蛋白質(zhì)，以進(jìn)一步明確鹿角中膠原蛋白質(zhì)與中醫(yī)臨床療效之間的聯(lián)系。