馬斐，田海燕，劉向凌，肖宗陽

(德州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 德州 253000)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構致癌物清單顯示，N-亞硝基二甲胺(NDMA)和N-亞硝基二乙胺(NDEA)均屬于2A類致癌物質(zhì)。ICH M7指南中也明確指出該類化合物具有較高致癌性[1]。近年來，隨著藥品監(jiān)管的不斷深入，在沙坦類原料藥中發(fā)現(xiàn)含有上述兩種雜質(zhì)，而且部分原料藥中NDMA含量超出歐盟標準200余倍，嚴重威脅患者的生命健康。因此，各原料藥公司已經(jīng)將NDMA和NDEA列入內(nèi)部質(zhì)量控制標準中。截至目前，國內(nèi)外已建立多種原料藥和制劑的NDMA和NDEA含量檢測方法[2-11]，包括利用氣相色譜-質(zhì)譜法進行纈沙坦及厄貝沙坦原料藥內(nèi)NDMA和NDEA含量檢測，利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測方法進行法莫替丁原料藥及制劑中NDMA含量檢測[11]等。成品藥物中NDMA及NDEA的檢驗與原料藥質(zhì)量控制相互補充，不可或缺，但仍未見沙坦類藥物制劑中NDMA及NDEA檢測方法的報道。

本研究利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)對纈沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、坎地沙坦4種藥物的不同劑型(片劑、膠囊、分散片)進行檢測，建立了沙坦類成藥制劑中NDMA及NDEA的GC-MS/MS檢測方法；對30批次沙坦類制劑進行檢測，發(fā)現(xiàn)1批陽性樣品，NDMA含量低于限量值，NDEA未檢出。本方法對于服務藥品監(jiān)管，構筑藥品安全最后一道防線具有積極的促進作用。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀7890B+7010B(美國Agilent公司)；精密電子天平XSE105(瑞士Mettler-Toledo公司)；試管渦旋振蕩器[德國海道爾夫(Heidolph)公司]；H1850R臺式高速冷凍離心機(長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司)； 13 mm×0.22 μm PTFE濾膜(上海安譜實驗室科技股份有限公司)。

NDMA對照品(2 000 μg·mL-1，純度100%，BW901305-2000-A,批號：A1909201，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；NDEA對照品(100 μg·mL-1，純度100%，BW902298-100-A,批號：A1911043，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；二氯甲烷(色譜純，科密歐公司)。

1.2 對照品及供試品溶液制備

1.2.1 對照品溶液 精密量取NDMA標準溶液0.5 mL至100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制備濃度為10 μg·mL-1的NDMA對照品溶液。分別精密量取NDMA對照品溶液(10 μg·mL-1)5 mL、NDEA對照品溶液(100 μg·mL-1)0.5 mL至同一200 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制成含NDMA、NDEA均為250 ng·mL-1的對照品儲備液。分別精密量取上述儲備液適量，用二氯甲烷稀釋，制備成質(zhì)量濃度為0、2.5、5、10、30、60、125、250 ng·mL-1的系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品處理 精密稱取各品種細粉適量(約相當于主成分100 mg)，置于15 mL離心管中，加入二氯甲烷5 mL，2 000 r·min-1渦旋混勻3 min，4 ℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm PTFE濾膜濾過，待進樣分析。

1.3 色譜條件 毛細管柱(型號Agilent VF-WAX ms，30 m×0.25 mm，0.25 μm)，升溫程序：初始柱溫40 ℃，保持0.5 min，20 ℃·min-1的速率升至200 ℃，保持8 min。進樣口溫度：250 ℃，載氣為氦氣，流速1 mL·min-1，不分流進樣，進樣量1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件 采用EI源，電壓為70 eV，接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，增益因子10，溶劑延遲3.5 min，多反應監(jiān)測檢測模式見表1。

表1 多反應監(jiān)測檢測模式參數(shù)

2 結果與討論

2.1 試驗條件的考察

2.1.1 儀器選擇及質(zhì)譜條件優(yōu)化 根據(jù)Carcinogenicity Potency Database(CPDB)數(shù)據(jù)庫中致癌物質(zhì)的TD50值來計算每日可接受的攝入量(ADI)，NDMA、NDEA TD50值分別為0.095 9和0.026 5 mg·(kg·d)-1[12-13]，按照人體重50 kg來計算NDMA的每天可接受攝入量為：0.095 9 mg·(kg·d)-1×50 kg/50 000 =96 ng·d-1，此時對應腫瘤發(fā)生風險為十萬分之一。結合藥品說明書及FDA公告中查閱到纈沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、坎地沙坦的每日最大用藥量分別為320、300、80、32 mg[13]。限度=ADI/每日最大用藥量(以纈沙坦為例，NDMA 0.3 ppm，NDEA 0.08 ppm)。根據(jù)供試品溶液中沙坦類的質(zhì)量濃度為0.02 g·mL-1，可見NDMA及NDEA的定量下限須低于3 ng·mL-1、0.8 ng·mL-1(即限度濃度的50%)。國內(nèi)外的檢測方法現(xiàn)有HPLC-UV、GC-MS[1-3]、GC-MS/MS[4-7]、LC-MS/MS、LC-HRMS等，有數(shù)據(jù)表明串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度比單四級桿質(zhì)譜要高10倍，直接進樣法比頂空靈敏度更高近1倍，為排除假陽性，滿足靈敏度要求，也鑒于目前串聯(lián)質(zhì)譜儀的普及情況，選擇GC-MS/MS直接進樣法和UPLC-MS/MS兩種方法進行測試。分別對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，對于目標物給予不同碰撞能量，找出信噪比高的離子對，GC-MS/MS質(zhì)譜條件見表1。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化 分別考察UPLC-MS/MS和GC-MS/MS分析檢測NDMA的靈敏度，發(fā)現(xiàn)GC-MS/MS的檢出限更低，因此選用GC-MS/MS進行檢測。有文獻報道[14]，使用非極性色譜柱會造成亞硝胺色譜峰拖尾，使用中等、強極性色譜柱亞硝胺色譜峰尖銳對稱，因此選用專為極性化合物設計的Agilent VF-WAX ms柱進行分析，能實現(xiàn)更高的靈敏度。

2.1.3 樣品前處理 對比取樣量相當于主成分500 mg和100 mg，分別進行加標回收，陽性樣品測定，陽性結果均一致，加標回收率、靈敏度均滿足要求，取樣量較大導致輔料太多，提取液比較黏稠，雜質(zhì)較多，對色譜柱及質(zhì)譜污染較大，所以選擇約相當于主成分100 mg的取樣量進行測定。

NDMA和NDEA在甲醇和二氯甲烷中均有較好的溶解性，因此分別采用甲醇和二氯甲烷對制劑進行提取，加標量0.005 μg·kg-1，提取溶劑體積均為5 mL，比較回收率，結果表明二氯甲烷的回收率及精密度較甲醇更好，因此采用二氯甲烷作為提取溶劑。

提取時間不足也是影響目標物回收率的重要因素，超聲效果較好，但是容易產(chǎn)熱，可能造成NDMA的產(chǎn)生[15]，且二氯甲烷易揮發(fā)，因此選擇渦旋提取，并要合理控制提取時間。設置1、3、10 min 3個提取時間，對比膠囊、分散片2種不同劑型5 ng·mL-1加標濃度下的平均回收率為78%、95%、93%，結果表明，提取時間為3 min時，可滿足檢驗要求。

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性 將溶劑(二氯甲烷)、對照品溶液、陰性樣品溶液、陰性樣品加標分別進樣測定，相同保留時間處，溶劑及陰性樣品均無干擾(見圖1～3)。

圖1 溶劑(二氯甲烷)提取離子色譜圖

圖2 NDMA、NDEA標準溶液提取離子色譜圖

圖3 加標樣品提取離子色譜圖

2.2.2 基質(zhì)效應 選取纈沙坦分散片、厄貝沙坦分散片、替米沙坦膠囊的空白樣品，分別配制低(5 ng·mL-1)、中(10 ng·mL-1)、高(30 ng·mL-1)3個水平的空白基質(zhì)加標溶液和二氯甲烷溶劑標準溶液，分別進樣測定，計算兩種溶液中NDMA、NDEA響應值的百分比。結果表明，NDMA、NDEA在3種不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應分別為90.1%～108.7%、92.6%～103.5%、95.1%～101.3%，表明基質(zhì)效應不影響檢測。

2.2.3 線性范圍 將“1.2.1”項下配制的系列濃度對照品溶液進樣測定。以所得峰面積為縱坐標Y，標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(X，ng·mL-1)，建立線性回歸方程，并計算相關系數(shù)(r)。結果表明，NDMA在0～250 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性良好，回歸方程為：Y=7 733.9X+1 443.1，r=0.999 7。NDEA在0～250 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性良好，回歸方程為：Y=4 024.1X-1 292.5，r=0.999 7。

2.2.4 檢出限和定量限 將1 ng·mL-1的NDMA和NDEA標準溶液用二氯甲烷定量逐級稀釋后進行測定，以信噪比S/N≥3作為檢出限，以信噪比S/N≥10作為定量限。結果表明方法的檢出限NDMA為0.1 ng·mL-1，NDEA為0.08 ng·mL-1，定量限NDMA為0.3 ng·mL-1，NDEA為0.2 ng·mL-1。

2.2.5 回收率與精密度 按照“1.2.2”項下精密稱取纈沙坦分散片、替米沙坦膠囊、厄貝沙坦分散片適量，至15 mL離心管中，各精密加入250 ng·mL-1的混合標準溶液適量，制備成低中高3個濃度的加標回收樣品各6份，依照本方法處理，進樣測定，計算平均回收率，結果見表2。NDMA平均回收率為86.9%～113.2%，RSD為2.7%～7.4%；NDEA平均回收率為91.1%～105.3%，RSD為2.8%～8.4%，表明回收率及重復性均良好。

表2 加標回收率及相對標準偏差

2.2.5 穩(wěn)定性與耐用性 將5 ng·mL-1的NDMA和NDEA空白樣品加標溶液，按照試驗條件放置0、1、2、4、8、12 h后進樣測定，記錄色譜圖和峰面積。結果顯示NDMA和NDEA的峰面積的RSD為7.5%和8.9%，說明該條件下進行樣品測定12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

改用相似固定相的柱子Agilent DB-WAX(0.25 mm×30 m，0.25 μm)進行分析，NDMA和NDEA的檢出限、分離度均能符合要求，表明方法耐用性良好。

2.3 樣品測定 應用所建立的方法對30批沙坦類制劑樣品進行檢測，根據(jù)《國家藥典委關于纈沙坦國家標準修訂稿》[15]中規(guī)定NDMA不得過0.3 ppm、NDEA不得過0.08 ppm。測得陽性樣品1批，其計算公式為：

[式中m0為規(guī)格80 mg，ω為平均片重或裝量0.160 2 g，m為取樣量0.367 3 g，V為定容體積5 mL，ω為含量(ppm)]，結果如表3所示。

表3 陽性樣品測定結果

3 結論

本研究建立了沙坦類制劑中NDMA、NDEA的GC-MS/MS檢測方法，其中，NDMA、NDEA的線性范圍為0～250 ng·mL-1，方法的檢出限NDMA為0.1 ng·mL-1、NDEA為0.08 ng·mL-1，定量限NDMA為0.3 ng·mL-1、 NDEA為0.2 ng·mL-1。NDMA平均回收率為86.9%～113.2%，RSD為2.7%～7.4%；NDEA平均回收率為91.1%～105.3%。RSD為2.8%～8.4%。應用該法對30批樣品進行檢測，檢出陽性樣品1批，NDMA含量低于限量，NDEA未檢出。本方法靈敏度高、專屬性好、回收率高、線性范圍寬，操作簡便、快速，已用于沙坦類制劑的檢驗，填補了該檢驗技術空白。