鄭 毅 黃 晨

東華大學(xué)紡織學(xué)院，上海201620

靜電紡納米纖維具有的柔軟及比表面積大等特性與天然細胞外基質(zhì)(ECM)相似，可以促進細胞的生長和增殖，所以被廣泛用作組織修復(fù)和再生的支架材料。該類支架材料中的納米多孔結(jié)構(gòu)不僅有助于營養(yǎng)和廢物的交換，還可以作為屏障，阻礙外部病原體的入侵[1-2]。

細胞在三維浸潤生長的過程中，其形態(tài)和功能類似于體內(nèi)的細胞，這有利于組織的修復(fù)和再生。傳統(tǒng)靜電紡膜的二維致密堆積結(jié)構(gòu)會嚴重阻礙細胞的三維浸潤生長。三維多孔支架能為細胞的滲透生長提供條件，故越來越多的學(xué)者開始制備三維支架并應(yīng)用于組織工程中。通常，制備三維靜電紡支架的方法有犧牲模板法[3-7]、雙組分彎曲法[8]、離子鹽法(如利用離子鹽添加劑[9]，帶有離子鹽的收集器[10]等)、機械鉆孔和氣體發(fā)泡結(jié)合法[11]等。這些方法制得的三維支架孔徑大，細胞滲透性改善，但制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)不穩(wěn)定，形成的多孔結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定，故實際應(yīng)用受限。

文獻[12]提到，增大纖維直徑，則靜電紡纖維支架的孔徑也隨之增大。為實現(xiàn)細胞在支架上的三維浸潤生長，最直接易行的方法就是增大纖維直徑，但簡單地增大纖維直徑可能使支架失去仿生特性。

本文將使用雙溶劑法制備表面具有納米溝槽紋理結(jié)構(gòu)的微米級左旋聚乳酸(PLLA)纖維支架。該支架具有大的纖維間孔和高度定向的表面凹槽，允許人體成纖維細胞(HFF)三維滲透生長，可更好地應(yīng)用于組織和器官的修復(fù)。

1 試驗準備

1.1 原料與試劑

原料：PLLA，平均摩爾質(zhì)量為190 000 g/mol，濟南岱罡生物工程有限公司; 二氯甲烷(DCM)，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司； HFF，中國科學(xué)院細胞庫； CCK-8試劑盒,日本同仁化學(xué)公司；戊二醛，質(zhì)量濃度為25 g/L，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

S4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM),日本日立公司；CPF-1100AI型毛細管流動孔隙率測定儀，美國PMI公司；WDW-20型醫(yī)用紡織品多功能強力儀，上海華龍測試儀器有限公司；ASAP 2460型多站擴展式全自動快速比表面與孔隙度分析儀，美國Micromeritics公司；Synergy H4光譜光度酶標儀，美國Bio-tek公司。

1.3 支架的制備

稱取一定量的PLLA溶于DCM和DMF的混合溶劑中，分別制備3種質(zhì)量濃度(100、130和230 g/L)的PLLA溶液。3種PLLA溶液采用不同混合比例的溶劑制備，其中：100 g/L PLLA溶液中VDCM∶VDMF=2∶1，130 g/L PLLA溶液中VDCM∶VDMF=3∶1，230 g/L PLLA溶液中VDCM∶VDMF=4∶1。3種PLLA溶液均攪拌24 h后靜置備用。

對上述所得均勻溶液進行靜電紡絲，其紡絲工藝條件：電壓為15 kV，針頭到接收板距離為20 cm，對應(yīng)于100、130和230 g/L PLLA溶液的紡絲速度分別為1、3和2 mL/h，針頭為21 G，溫度為25 ℃，環(huán)境相對濕度為45%，控制總擠出量為5 mL。

100、130和230 g/L PLLA溶液制得的支架試樣依次編號為1#、2#和3#。

1.4 細胞培養(yǎng)與種植

將HFF細胞培養(yǎng)在含有10%(質(zhì)量分數(shù))胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并一起放入溫度為37 ℃、含CO2(體積分數(shù)為5%)的培養(yǎng)箱中，每隔3 d更換培養(yǎng)基。當(dāng)細胞融合度達到85%時加入適量胰酶進行消化，離心后以1∶3的比例傳代，重懸于高糖DMEM培養(yǎng)基中。本文試驗所用的HFF細胞為第12～20代細胞。

將3種PLLA纖維支架試樣裁剪成直徑為14 mm的圓形，放入24孔板內(nèi)，在紫外燈下照射30 min滅菌，之后將細胞以每孔1×104的密度種植在PLLA纖維支架試樣上。

2 性能測試

2.1 支架性能測試

2.1.1 表觀形態(tài)

對PLLA纖維支架試樣分別進行噴金處理，采用FE-SEM觀察試樣的表觀形態(tài)，并根據(jù)所得的SEM圖像，使用Image J軟件對纖維直徑進行測量。

2.1.2 孔徑

將PLLA纖維支架試樣裁剪成3 cm×3 cm的大小，放入孔徑儀的專屬油劑中充分浸潤，然后使用毛細管流動孔隙率測定儀測定試樣的孔徑和孔徑分布。

2.1.3 拉伸性能

根據(jù) GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片 厚度測定 機械測量法》和 GB/T 1040．3—2006《塑料拉伸性能的測定 第3部分：薄塑和薄片的試驗條件》，將PLLA纖維支架試樣裁剪成10 cm×1 cm的長條狀，使用醫(yī)用紡織品多功能強力儀，設(shè)定拉伸速度為10 mm/min，測定試樣的應(yīng)力和應(yīng)變。

2.1.4 BET比表面積

使用多站擴展式全自動快速比表面與孔隙度分析儀測定PLLA纖維支架試樣的比表面積。

2.2 體外生物試驗

2.2.1 細胞形態(tài)

HFF細胞接種到PLLA纖維支架試樣上24 h后，加入質(zhì)量濃度為25 g/L的戊二醛進行固定，再用梯度酒精脫水2次，之后在CO2臨界干燥點干燥，噴金后用FE-SEM觀察細胞形態(tài)。

2.2.2 細胞增殖測試

細胞種植到PLLA纖維支架試樣上后，培養(yǎng)1、3和7 d，并于每個時間點將180 μL培養(yǎng)液和20 μL CCK-8試劑加入到每個孔中，在37 ℃下孵育4 h后從 24 孔培養(yǎng)板的每個孔中取出100 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到干凈的96孔板內(nèi)，利用光譜光度酶標儀測定溶液在450 nm處的吸光度。

2.2.3 細胞滲透生長測試

采用Transwell試驗評估細胞浸潤性。將具有PLLA纖維支架的Transwell半透膜置于24孔板中，在24孔板底部放置hFDM生長因子以誘導(dǎo)細胞進行滲透生長。將總數(shù)為1×105的HFF細胞接種在Transwell半透膜的PLLA纖維支架(厚度均為300.00 μm) 上，細胞遷移72 h后移除PLLA纖維支架，用體積分數(shù)為4%的福爾馬林固定滲透Transwell半透膜的細胞，并用結(jié)晶紫溶液對細胞進行染色。使用光學(xué)顯微鏡對結(jié)果進行拍攝，Image J軟件量化滲透的細胞占據(jù)的面積百分比。通過比較每組滲透過Transwell半透膜的細胞所占據(jù)的面積比，判斷細胞滲透生長的水平。

3 結(jié)果與討論

3.1 支架性能

3.1.1 纖維形態(tài)與直徑分布

3種質(zhì)量濃度的PLLA溶液制得的1#、2#和3#支架試樣的SEM照片及計算得到的直徑分布見圖1。

從圖1a)和b)可以看出：所有PLLA纖維的直徑都比較均勻，且隨著紡絲液濃度的提高，靜電紡纖維的直徑也隨之增大，3#支架試樣中PLLA纖維直徑最大；1#支架試樣中PLLA纖維表面最為光滑，2#和3#支架試樣中PLLA纖維的表面呈現(xiàn)出明顯的平行溝槽結(jié)構(gòu)。

從圖1c)可以看出：1#支架試樣中PLLA纖維平均直徑為0.81 μm，標準偏差0.13 μm；2#支架試樣中PLLA纖維平均直徑為1.06 μm，標準偏差0.21 μm；3#支架試樣，即當(dāng)紡絲液質(zhì)量濃度達到230 g/L時，PLLA纖維平均直徑增大到3.01 μm，標準偏差0.46 μm。

圖1 PLLA纖維的SEM照片及其直徑分布

產(chǎn)生溝槽的原因?qū)嶋H上是一個相分離的過程，原理見圖2，主要是因為DCM和DMF兩種溶劑的沸點差距較大所致。

圖2 納米溝槽形成原理

紡絲過程中，納米溝槽的形成分三步：

第一步，DCM會率先從射流中揮發(fā)，吸熱導(dǎo)致空氣中的水氣凝結(jié)在纖維表面，產(chǎn)生相分離；

第二步，水氣和殘留的DCM被靜電場拉伸后進一步揮發(fā)，在纖維上留下孔洞，此時噴出的紡絲液依舊保持流動性；

第三步，隨著紡絲過程的進行，孔洞在電場的作用下被逐漸拉伸、結(jié)合，形成平行溝槽。

3.1.2 孔徑

圖3是3種PLLA纖維支架試樣孔徑的測試結(jié)果。從圖3可以看出：本試驗制得的靜電紡PLLA纖維支架試樣的孔徑是不均勻的，孔徑大體呈正態(tài)分布；PLLA纖維支架的孔徑大小與纖維直徑呈正相關(guān)，纖維直徑越大，支架的平均孔徑也越大。1#試樣和2#試樣中PLLA纖維直徑相差不大，兩者的平均孔徑相差也不大，分別為2.81 μm和3.13 μm；3#試樣的PLLA纖維平均直徑在3.01 μm，平均孔徑達到12.42 μm。

圖3 PLLA纖維支架試樣的孔徑分布

3.1.3 拉伸性能

圖4是3種PLLA纖維支架試樣的拉伸性能測試結(jié)果。從圖4可以看出，隨著纖維直徑的增大，支架試樣的力學(xué)性能反而下降。這是因為纖維直徑增大，支架的孔徑也隨之增大，纖維與纖維之間的纏結(jié)點變少，故導(dǎo)致其力學(xué)性能降低。

圖4 PLLA纖維支架試樣的應(yīng)力-應(yīng)變曲線

3.1.4 BET比表面積

由于纖維直徑約為3.00 μm的光滑靜電紡膜難以制備，故本試驗選擇與2#試樣纖維直徑接近的聚氨酯(PU)靜電紡膜作為參考進行測試，PU纖維的平均直徑為1.14 μm，標準偏差為0.15 μm。表1是3種PLLA纖維支架試樣和PU靜電紡膜的BET比表面積(SBET)測試結(jié)果。

表1 PLLA纖維支架試樣和PU靜電紡膜的BET比表面積測試結(jié)果

由表1可以看出：隨著纖維直徑的增加，PLLA纖維支架的BET比表面積下降，這與以往的研究結(jié)果一致；PU靜電紡膜的BET比表面積甚至小于3#試樣的BET比表面積，可以推斷，在纖維直徑相近的情況下，溝槽結(jié)構(gòu)的存在可以增加支架的BET比表面積。

3.2 體外生物試驗

3.2.1 細胞形態(tài)

圖5是細胞的SEM照片。根據(jù)以往的研究，細胞更容易黏附在表面粗糙的支架上[13]。從圖5可以看出，1#試樣的細胞黏附效果最佳，2#和3#試樣上也有細胞黏附，故可以推測該結(jié)果系與纖維表面溝槽的存在使得支架的BET比表面積增大有關(guān)；從細胞在3#試樣上的生長情況不難看出，細胞有沿著纖維生長的趨勢，說明平行溝槽會誘導(dǎo)細胞的生長行為。

圖5 細胞生長的SEM照片

3.2.2 CCK-8細胞增殖試驗

CCK-8細胞增殖試驗結(jié)果見圖6，圖中“*”表示該試樣與1#試樣相比p<0.05，具有顯著性。

圖6 CCK-8細胞增殖試驗結(jié)果

從圖6可以看出：盡管1#和2#試樣的直徑、孔徑相差不大，但2#試樣上培養(yǎng)的細胞增殖情況略優(yōu)于1#試樣，這與2#試樣上的溝槽結(jié)構(gòu)有利于細胞發(fā)生增殖和遷移有關(guān)；3#試樣上培養(yǎng)的細胞增殖情況優(yōu)于2#試樣，可見除去纖維的表面形態(tài)外，支架的孔徑大小也會影響細胞的增殖情況，且孔徑越大，細胞的增殖情況越好，該結(jié)果和以往的研究結(jié)果基本一致[14]。

3.2.3 細胞滲透生長

圖7是Transwell試驗裝置示意。

圖7 Transwell試驗裝置示意

圖8是用光學(xué)顯微鏡拍攝的Transwell試驗結(jié)果。

圖8 Transwell 試驗結(jié)果

圖8中，大量被染成紫色的細胞出現(xiàn)在視野范圍內(nèi)，且HFF細胞在3#試樣上的滲透情況比在1#和2#試樣上的多很多。這說明3種試樣在厚度相同的情況下，3#試樣因具有最大的孔徑而細胞更易滲透支架。

圖9對Transwell試驗結(jié)果進行了量化分析。其中“*”和“#”表示該試樣分別與1#和2#試樣比較時p<0.05，具有顯著性。

圖9 Transwell 試驗結(jié)果量化分析

從圖9可以看出，細胞滲透1#、2#和3#試樣占據(jù)視野范圍內(nèi)的面積比例分別為0.77%、2.27%和12.09%， 這非常直觀地表明了細胞在大孔徑的3#試樣上滲透效果最好，有效地實現(xiàn)了細胞的三維滲透生長。

4 結(jié)論

采用靜電紡絲技術(shù)，在沒有額外處理的情況下，通過控制紡絲液濃度和溶劑種類，一步制備了同時具備納米和微米結(jié)構(gòu)優(yōu)勢的靜電紡PLLA纖維支架。纖維表面的納米溝槽結(jié)構(gòu)對細胞的黏附和增殖情況有積極影響，還能引導(dǎo)細胞沿著溝槽方向生長。紡絲液濃度的提高可使纖維直徑增大。當(dāng)PLLA質(zhì)量濃度達到230 g/L時，纖維的平均直徑增大到3.00 μm以上，支架的平均孔徑擴大到12.00 μm以上，細胞能夠通過支架內(nèi)部相通的孔道進行滲透生長，且其三維滲透生長的效果遠優(yōu)于傳統(tǒng)的二維靜電紡膜。本研究制備的靜電紡微米纖維支架更有利于細胞的三維滲透生長，以及組織和器官的形成，未來有望應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)、生物反應(yīng)器及骨修復(fù)等領(lǐng)域。