宋少華，李海艦，李莉娟，方曉琳

（廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510317）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種比較常見的炎癥性疾病，臨床上UC患者常表現(xiàn)為腹脹、腹痛、腹瀉、便血以及炎癥等，嚴(yán)重影響UC患者的身體健康[1]。目前，對UC病因的探究尚不完全清楚，其與機(jī)體生理、遺傳因素、環(huán)境和心理變化等均關(guān)系密切[2]。目前，臨床上常用于治療UC的藥物主要包括柳氮磺吡啶、氨基水楊酸、糖皮質(zhì)類激素和免疫抑制劑等，雖然其短期對UC患者的癥狀改善有益，但如長期應(yīng)用或大劑量應(yīng)用則可引起多種不良反應(yīng)的發(fā)生[3]。近些年來，越來越多的中藥有效成分對UC的治療展現(xiàn)出良好的效果[4]，其對抗UC新藥的挖掘具有較好的啟發(fā)作用。針對目前開發(fā)抗UC新藥的需要仍迫在眉睫，從中藥尋找抗UC新藥是一種可行的新方法。

白芷是傘形科植物杭白芷或白芷的干燥根，具有祛風(fēng)止痛、解表散寒、消腫排膿、燥濕止帶以及宣通鼻竅的功效[5]。白芷乙素是白芷植物中一種呋喃香豆素類活性成分，其抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管和抗凋亡等新的藥理作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)[6]。已有研究報道白芷可通過降低IL-1β水平，升高IL-10水平，以及下調(diào)NF-κB蛋白活性，從而改善UC大鼠的癥狀[7]。此外，臨床研究報道茵陳白芷湯治療慢性結(jié)腸炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)型39例取得較好的效果[8]。但是白芷乙素對UC是否有防治作用目前未見研究報道?；谇捌诒菊n題組預(yù)實(shí)驗(yàn)初步篩查發(fā)現(xiàn)白芷乙素對UC小鼠具有明顯的癥狀改善作用，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建急性UC小鼠模型，探討白芷乙素對小鼠UC的作用及其機(jī)制，以期為日后抗UC新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

白芷乙素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海晨易生物科技有限公司，批號：20190205）；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒（博士德生物技術(shù)有限公司，批號分別為23913119104、42574412547、32565248754、65487547821）；SOD和MDA檢測試劑盒（南京建成生物有限公司，批號分別為20210412、20210324）；TLR4和NF-κBp65單克隆抗體（abcam公司，批號分別為HM2298、CH4257）。

1.2 動物分組與給藥

2月齡雄性SPF級C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量18~22 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXX（湘）2018-0003。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始本實(shí)驗(yàn)。將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組（LD組：0.5 g/kg）、白芷乙素低劑量組（BZ-L：6 mg/kg）、白芷乙素中劑量組（BZ-M：12 mg/kg）和白芷乙素高劑量組（BZ-H：24 mg/kg），每組10只。建模當(dāng)天灌胃給藥，連續(xù)7 d，空白對照組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.3 潰瘍性結(jié)腸炎模型構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[9]方法構(gòu)建小鼠UC模型，具體方法如下：小鼠連續(xù)自由飲用3%DSS水溶液7 d，其中每隔1天更換新配的DSS溶液?？瞻讓φ战M飲用正常水。

1.4 疾病活動指數(shù)（DAI）評分

實(shí)驗(yàn)過程中每日觀察各組小鼠的行為學(xué)，觀察大便的性狀、便血等，主要參照文獻(xiàn)[10]方法對各組小鼠進(jìn)行DAI評分，詳見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of DAI

1.5 結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分

本實(shí)驗(yàn)第7天結(jié)束后，采用頸椎脫臼方式處死小鼠，剖開動物腹腔，小心取出小鼠結(jié)腸部，并縱向剪開結(jié)腸，觀察結(jié)腸組織大體的形態(tài)學(xué)變化，并按表2的評分標(biāo)準(zhǔn)對動物進(jìn)行評分[11]。

表2 結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria of morphological injury of colon tissue

1.6 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小心切取各組小鼠統(tǒng)一部位的結(jié)腸組織，10%（φ）中性甲醛浸泡72 h后，按以下步驟進(jìn)行石蠟包埋切片以及HE染色，石蠟包埋步驟：流水沖洗結(jié)腸組織過夜，70%（φ）酒精浸泡24 h，80%酒精浸泡24 h，95%酒精浸泡6 h，100%酒精浸泡3 h，二甲苯浸泡5 min，石蠟浸泡3 h后，進(jìn)行石蠟包埋及切片（厚度為5 μm）。HE染色步驟：二甲苯浸泡2次，5 min/次，100%酒精浸泡5 min，95%酒精浸泡5 min，70%酒精浸泡5 min，蒸餾水浸泡5 min，蘇木素染液浸泡5 min，伊紅染液浸泡15 s，晾干后，封片，鏡檢。

1.7 結(jié)腸組織炎癥因子指標(biāo)檢測

按質(zhì)量（結(jié)腸組織）∶體積（生理鹽水）比=1∶9制備結(jié)腸組織勻漿，準(zhǔn)確稱取結(jié)腸組織，加入9倍體積生理鹽水，使用玻璃勻漿器于4℃冰上研磨，4℃，4 000 r/min離心15 min，分離上清，置于?80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒檢測結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。

1.8 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

結(jié)腸組織勻漿制備同“1.7”，按檢測試劑盒說明書步驟檢測結(jié)腸組織SOD活性以及MDA水平。

1.9 結(jié)腸組織TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平檢測

結(jié)腸組織勻漿制備同“1.7”，隨后100℃水浴加熱變性蛋白，測定蛋白濃度。每孔上樣40 μg蛋白，常規(guī)電泳分離和轉(zhuǎn)PVDF膜，5%BSA封閉液封閉2 h，分別使用的TLR4（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶2 000）、β-actin抗體（1∶2 000）4℃孵育過夜和山羊抗兔IgG抗體（1∶3 000）室溫孵育2 h，PBST清洗5次，5 min/次，滴加200 μL顯影劑后，使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，計量資料用表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠均無異常表現(xiàn)。模型組小鼠造模后第2天糞便開始出現(xiàn)異常，并逐漸變軟和稀，第5天出現(xiàn)肉眼可見的血便現(xiàn)象和肛門出血。經(jīng)給藥治療后，小鼠以上癥狀有比較明顯的改善，其中BZ-H組和LD組改善作用最優(yōu)。

2.2 各組小鼠DAI評分

與空白對照組比較，模型組的DAI評分明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的DAI評分明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組DAI評分改善效果最優(yōu)，見表3。

表3 各組小鼠DAI評分結(jié)果Table 3 DAI score of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分

與空白對照組比較，模型組的結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分則明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分改善效果最好，詳見表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分結(jié)果Table 4 Morphological injury score of colon tissue of mice in each group(±s,n=10)

表4 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)損傷評分結(jié)果Table 4 Morphological injury score of colon tissue of mice in each group(±s,n=10)

與空白對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

組別空白對照組模型組LD組BZ-L組BZ-M組BZ-H組分?jǐn)?shù)0.00±0.00 4.36±0.68**2.65±0.57##3.76±0.78#3.23±0.45#2.55±0.76##

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

空白對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮排列整齊，結(jié)腸絨毛完整，結(jié)腸腸腺多種細(xì)胞排列整齊，未炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠腸絨毛破損嚴(yán)重，有脫落壞死，大部分腸腺出現(xiàn)壞死和溶解，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。給予藥物后，以上損傷出現(xiàn)不同程度的改善，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)分層比較清晰，結(jié)腸腸腺細(xì)胞排列比較整齊，炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其中BZ-H組和LD組結(jié)腸組織病理變化改善最優(yōu)，見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Figure 1 Histopathological changes of colon tissue of mice in each group(HE staining,200×)

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平比較

與空白對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高（P<0.01），而抑炎因子IL-10的水平明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低（P<0.05），而抑炎因子IL-10水平則明顯升高（P<0.05），其中BZ-H組和LD組改善效果最優(yōu)，見圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子水平Figure 2 Levels of inflammatory factors in colonic tissue of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織SOD活性和MDA水平

與空白對照組比較，模型組結(jié)腸組織SOD活性明顯降低（P<0.01），而MDA水平明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組的SOD活性明顯升高（P<0.01），而MDA水平明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組改善效果最好，見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織SOD活性和MDA水平Figure 3 SOD activity and MDA level in colon tissue of mice in each group(xˉ±s,n=10)

2.7 結(jié)腸組織TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平

與空白對照組比較，模型組結(jié)腸組織的TLR4和NF-κB p65的蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組結(jié)腸組織的TLR4和NF-κB p65的蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.05），其中BZ-H組和LD組改善效果最好，見圖4。

圖4 各組結(jié)腸組織TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平Figure 4 Expression TLR4 and NF-κB p65 in colon tissues of mice in each group(xˉ±s,n=10)

3 討論

UC是一種慢性非特異性炎癥性的腸道疾病，UC患者經(jīng)常出現(xiàn)腹痛、黏液便和排膿血便等癥狀，目前，其發(fā)病機(jī)制尚不得知，可能是由于外部環(huán)境引起宿主的免疫反應(yīng)和基因改變等[12]。柳氮磺吡啶在臨床上常用于治療UC的常用藥物，但長期使用多種嚴(yán)重副作用，如中性粒細(xì)胞缺乏、藥疹和剝脫性皮炎等[13]，故抗UC新藥的開發(fā)仍是目前極為重要的任務(wù)之一。

本實(shí)驗(yàn)通過自由飲用3%DSS溶液構(gòu)建小鼠UC模型，觀察白芷乙素抗UC的作用效果。本研究發(fā)現(xiàn)，白芷乙素各劑量組均能明顯改善UC小鼠癥狀，如降低DAI評分，減輕結(jié)腸組織損傷以及減少結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞的浸潤，其中BZ-H組的改善效果最優(yōu)。在炎癥發(fā)展過程中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10作為重要的細(xì)胞因子參與到多種的炎癥信號通路中。其中TNF-α和IL-1β常用于評價機(jī)體炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[14]。IL-1β參與了UC患者的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而TNF-α參與了UC患者結(jié)腸黏膜損傷[15]，兩者與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IL-10是一種重要的炎癥抑制因子，其可通過抑制機(jī)體多種炎癥因子的合成，如TNF-α、IL-1β、IL-6等[16]，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。此外，IL-10還可調(diào)節(jié)機(jī)體腸道細(xì)胞的免疫平衡，維持正常腸道黏膜微生態(tài)平衡[17]。SOD活性和MDA水平是反映機(jī)體氧化損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)白芷乙素能夠顯著降低UC小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平，升高結(jié)腸組織IL-10水平和SOD活性，改善UC小鼠的炎癥和氧化損傷。

NF-κB是UC炎癥過程得以持續(xù)發(fā)展的重要指標(biāo)，其通過促進(jìn)多種致病因子表達(dá)和釋放[19]，如TNF-α、IL-1β、IL-6引起機(jī)體產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)的炎癥反應(yīng)，使炎癥過程持續(xù)放大，進(jìn)一步導(dǎo)致腸黏膜損傷，引導(dǎo)UC的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，白芷乙素各劑量組可明顯降低UC小鼠結(jié)腸組織中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平，提示白芷乙素可抑制UC小鼠TLR4/NF-κB p65信號通路，這可能是其抗UC的重要作用機(jī)制。

綜上所述，白芷乙素對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥、抗氧化損傷以及調(diào)節(jié)TLR/NF-κB信號通路有關(guān)。本研究為抗UC新藥研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。