蔣鵬娜，李竹英，孫國東，霍金海

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

平喘顆粒來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科臨床常用經(jīng)驗方溫陽平喘湯，在臨床上應(yīng)用已近50年。平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母等9味藥組成，具有溫陽益氣、化痰平喘之功效，用于治療哮喘慢性持續(xù)期陽虛痰盛型，亦可用于具有相同癥狀的其他咳喘病，具有較好的臨床療效[1-2]。

平喘顆粒是由9味中藥組成的復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，前期僅采用高效液相色譜法測定淫羊藿苷、黃芪甲苷的含量，難以全面控制制劑質(zhì)量[3]。因此，開發(fā)一種能夠快速分析和表征平喘顆?；瘜W(xué)成分的方法，對于有效控制方劑質(zhì)量，進一步研究其作用機制及二次開發(fā)均具有現(xiàn)實意義。

近年來，將液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度相結(jié)合，尤其是與高分辨質(zhì)譜和多級質(zhì)譜聯(lián)合使用的技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于中草藥成分的分析，為研究天然產(chǎn)物開辟了全新的途徑。在前期總結(jié)平喘顆粒藥味已報道化合物一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以及研究系列對照品二級質(zhì)譜裂解規(guī)律的基礎(chǔ)上，結(jié)合AB SCIEX公司Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software提供的1 000多種 中 藥對照品MS/MS譜圖信息，本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)對平喘顆粒樣品進行在線分離分析研究，利用UPLC一維的保留時間鎖定化合物，通過二維的精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰度比確定分子式，再通過對照品比對或質(zhì)譜裂解規(guī)律分析鑒定或推斷結(jié)構(gòu)式，旨為平喘顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC（美國Waters公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱）；AB SCEIX Triple-TOFTM5600+型質(zhì)譜儀（AB SCI‐EX，USA，配有ESI源和APCI源）；數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF 1.6 software（AB SCEIX，USA）；數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)：Peakview 2.0/masterview1.0 software（AB SCEIX，USA）、Markerview1.2.1（AB SCEIX，USA）、Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software（AB SCIEX，USA）。

KQ-300DB數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）；BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）；LG16-W高速離心機（北京京立離心機有限公司）；ATC2-5-U艾科浦超純水機（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；MDF-382E（N）超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 藥材與對照品

平喘顆粒樣品由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，規(guī)格10 g/袋。

芒柄花素（C-018-140126）、毛蕊異黃酮苷（M-020-1170926）、五味子乙素（W-001-140801）、綠原酸（RFS-L00701908029）、芒果苷（M-018-180511）、次黃 嘌 呤（C-069-181216）、氧 化 前 胡 素（Y-151-181008）由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；次烏頭堿（798-9403）、酪氨酸（140624-200805）由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加甲醇分別制成約50 μg/mL的溶液作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取平喘顆粒5.0 g，精密稱定，加75%（體積分數(shù)，下同）甲醇25 mL超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液13 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.3 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），AQUITY UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column預(yù)柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫（0~5 min，5%~25%B；5~15 min，25%~65%B；15~20 min，65%~70%B；20~29 min，70%~100%B；29~30 min，100%~100%B；30～30.1 min，100%~5%B；30.1~35 min，5%~5%B）；柱溫為30℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正負離子源電壓分別為5 500 V/-4 500 V，離子源溫度為550℃，裂解電壓（DP）分別為80 V/-80 V，碰撞能量（CE）分別為35 eV/-35 eV，碰撞能量擴展（CES）分別為15 eV/-15 eV。霧化氣體為氮氣，輔 助 氣Gas1為379.225 kPa，輔 助 氣Gas2為379.225 kPa，氣簾氣CurGas為241.325 kPa。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為m/z80~1 500，IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為m/z50~1 500，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。

2.5 數(shù)據(jù)分析

2.5.1 目標(biāo)性篩查（1）利用已建成的平喘顆?；衔镆患壻|(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（包括化合物分子式、分子量、中英文名稱、CAS號、結(jié)構(gòu)類型、植物來源及參考文獻信息），使用Peakview 2.0/Masterview 1.0軟件中的“Targeted Peak Finding”功能載入已選擇的數(shù)據(jù)，設(shè)置Mass Error（質(zhì)量數(shù)偏差）<10×10-6，權(quán)重=30%；Isotope（同位素分布）差異<10%，權(quán)重=30%；Formu‐la Finder score（分子式查找）>70%，權(quán)重=40%；利用masterview1.0軟件目標(biāo)篩查功能對組分樣本進行篩查。（2）使用Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software（AB SCIEX，USA）進行篩查，該數(shù)據(jù)包含了1 000余種中草藥對照品的二級譜圖信息與樣品中的化合物進行自動匹配。

2.5.2 非目標(biāo)性篩查 將采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入Masterview 1.0（AB SCIEX，USA）軟件，通過peak finding options功能將數(shù)據(jù)中所有色譜峰按照設(shè)置參數(shù)母離 子 強 度>3 000 counts；S/N>10；MAX Element C50H200O50N20提取出來，按峰強度排序，選擇離子強度大且二級譜圖質(zhì)量較好的化合物作為結(jié)構(gòu)分析重點。

2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

在正負離子模式下，大多數(shù)化合物會產(chǎn)生[M+H]+或[M?H]?分子離子，Triple TOFTM 5600+高分辨質(zhì)譜能夠在化學(xué)位移δ=5誤差范圍內(nèi)測定大多數(shù)離子的精確質(zhì)量數(shù)，并準(zhǔn)確測定同位素豐度比。因此，通過Peakview 2.0 software軟件的Formula Finder功能，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)及同位素豐度比可確定化合物的分子式。對于有對照品信息的化合物，進一步比對保留時間及二級質(zhì)譜信息進行結(jié)構(gòu)鑒定；對于無法獲得對照品的化合物，首先，依據(jù)其碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)計算其碎片組成，對比chemspider數(shù)據(jù)庫給出的可能結(jié)構(gòu)式，再研究相似結(jié)構(gòu)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過Peakview 2.0軟件分析化合物質(zhì)譜裂解特征以及文獻對比，結(jié)合二級譜圖相似度，從而推斷化合物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與討論

3.1 UPLC/Q-TOF/MS數(shù)據(jù)采集結(jié)果

由于平喘顆?；瘜W(xué)成分復(fù)雜，采用一種模式很難顧全所有的化合物，因此采用正負2種離子掃描模式進行掃描，正負離子模式下的總離子色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在正負離子模式下，各化合物均獲得了良好的分離效果及離子化效率。

圖1 平喘顆粒正負離子模式下總離子流圖Figure 1 TIC chromatograms of Pingchuan granules in positive and negative modes

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

鑒定或推斷了平喘顆粒中35個化合物的結(jié)構(gòu)，包括15個黃酮類化合物，主要來源于黃芪、淫羊藿、太子參、款冬花、知母等藥材；4個生物堿類化合物，來源于附子、罌粟殼及太子參；4個木脂素類化合物，全部來源于五味子；6個有機酸類化合物，分別來源于麻黃、款冬花、太子參、地龍、知母、附子；2個氨基酸類化合物，均來源于太子參、地龍；3個嘌呤類化合物，來源于太子參、地龍、知母；1個香豆素類化合物，來源于知母，結(jié)果見表1。

表1 （續(xù)）

表1 平喘顆粒中化合物結(jié)構(gòu)信息表Table 1 Compound structure information of Pingchuan granules by UPLC-ESI-Q-TOF/MS

3.2.1 黃酮類成分的鑒定及分析 化合物1為黃芪、太子參、知母中共有的典型化合物，其準(zhǔn)分子離子269[M+H]+豐度最高，首先A環(huán)上甲氧基斷裂失去甲基并發(fā)生氫重排，形成253[M+H-CH4]+碎片離子，而此離子碎片同時發(fā)生3種裂解途徑：一種失去C環(huán)上的CO中性碎片形成225[M+H-CO-CH4]+碎片離子，此碎片繼續(xù)碎裂失去B環(huán)上的CO中性碎片形成197[M+H-2CO-CH4]+及181[M+H-2COOCH4]+碎片離子；另一個途徑則失去B環(huán)上的4’-位的甲氧基形成237[M+H-O-CH4]+碎片離子，準(zhǔn)分子離子也可A、C環(huán)發(fā)生裂解重排后產(chǎn)生213[M+HC2O2]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及標(biāo)準(zhǔn)品比對[4]，推斷化合物1為芒柄花素，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖2、圖3。

圖2 芒柄花素二級質(zhì)譜圖Figure 2 MS/MS spectrum for formononetin

圖3 芒柄花素可能的裂解途徑Figure 3 Possible fragmentation path way for formononetin

化合物2是黃芪、太子參共有的一個典型黃酮類成分，其準(zhǔn)分子離子285[M+H]+豐度最高，其裂解路線較為單一，首先B環(huán)上4’-位甲氧基斷裂失去甲基形成270[M+H-CH3]+碎片離子，此離子碎片進一步丟失4’-位的OH并與3’-位羥基發(fā)生重排而形成253[M+H-CH3-OH]+碎片離子，253碎片失去CO中性分子形成225[M+H-CH3-OH-CO]+碎片離子，并發(fā)生A環(huán)RDA反應(yīng)開環(huán)失去1個C形成213[M+HCH3-OH-CO-C]+碎片離子；另一條裂解途徑則由準(zhǔn)分子離子直接丟失B環(huán)并發(fā)生重排產(chǎn)生碎片離子137[M+H-C9H8O2]+，此碎片提示A環(huán)上僅有1個羥基存在。根據(jù)裂解方式及對照品比對，推斷化合物2為毛蕊異黃酮，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖4、圖5。

圖4 毛蕊異黃酮二級質(zhì)譜圖Figure 4 MS/MS spectrum for calycosin

圖5 毛蕊異黃酮可能的裂解途徑Figure 5 Possible fragmentation path way for calycosin

3.2.2 生物堿類成分的鑒定及分析 生物堿類成分結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，化合物17為附子中典型的生物堿成分，其準(zhǔn)分子離子616[M+H]+豐度最高，裂解途徑分為兩個方向：一個方向是失去飽和六元環(huán)上的甲氧基并發(fā)生氫的重排反應(yīng)，形成584[M+H-OCH4]+碎片離子；另一個方向是失去飽和7元環(huán)上的乙酸根離子并發(fā)生氫重排形成556[M+H-CH3COOH]+碎片離子，此離子繼續(xù)失去飽和六元環(huán)上的甲氧基并發(fā)生氫的重排反應(yīng)，形成524[M+H-CH3COOHOCH4]+碎片離子，而此碎片發(fā)生一系列裂解失去苯基、CO、甲基及開環(huán)失去N基并發(fā)生重排后形成338[M+H-CH3COOH-OCH4-C12H12NO]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及對照品比對[5]，推斷化合物17為次烏頭堿，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖6、圖7。

圖6 次烏頭堿二級質(zhì)譜圖Figure 6 MS/MS spectrum for hypaconitine

圖7 次烏頭堿可能的裂解途徑Figure 7 Possible fragmentation path way for hypaconitine

3.2.3 木脂素類成分的鑒定及分析 化合物21為五味子中典型的木脂素類成分，其準(zhǔn)分子離子401[M+H]+的裂解分為兩條路線：一條為連續(xù)失去一個甲基及O形成386[M+H-CH3]+碎片離子及370[M+HCH3-O]+碎片離子；另外一條則由準(zhǔn)分子離子401[M+H]+的連續(xù)發(fā)生八元環(huán)斷裂并發(fā)生重排反應(yīng)形成300[M+H-5CH2-OCH3]+碎片離子，此碎片繼續(xù)丟失甲基形成285[M+H-5CH2-OCH3-CH3]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及對照品比對[6-7]，推斷化合物21為五味子乙素，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖8、圖9。

圖8 五味子乙素二級質(zhì)譜圖Figure 8 MS/MS spectrum for schisandrin B

圖9 五味子乙素可能的裂解途徑Figure 9 Possible fragmentation path way for schisandrin B

3.2.4 有機酸類成分的鑒定及分析 化合物29為典型的常見有機酸類成分，其準(zhǔn)分子離子355[M+H]+豐度比較小，說明準(zhǔn)分子離子所需極少能量即可打碎，而準(zhǔn)分子離子極易失去奎寧?；纬韶S度最高的163[M+H-C7H12O6]+碎片離子，此離子失去苯環(huán)上的1個H2O形成145[M+H-C7H12O6-H2O]+碎片離子，同時也能失去CO形成135[M+H-C7H12O6-CO]+碎片離子，繼而失去苯環(huán)上的1個H2O形成117[M+H-C7H12O6-CO-H2O]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及對照品比對[8]，推斷化合物29為綠原酸，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖10、圖11。

圖10 綠原酸二級質(zhì)譜圖Figure 10 MS/MS spectrum for chlorogenic acid

圖11 綠原酸可能的裂解途徑Figure 11 Possible fragmentation path way for chlorogenic acid

3.2.5 氨基酸類成分的鑒定及分析 化合物31為常見氨基酸，其準(zhǔn)分子離子182[M+H]+豐度比較小，裂解途徑有兩條路線，首先失去1個H2O及NH3中性碎片并發(fā)生環(huán)合反應(yīng)形成147[M+H-H2O-NH3]+碎片離子，此離子發(fā)生開環(huán)反應(yīng)失去2個C形成123[M+H-H2O-NH3-2C]+碎片離子，準(zhǔn)分子離子亦可連續(xù)失去甲酸根及NH3形成136[M+H-HCOOH]+碎片離子和119[M+H-HCOOH-NH3]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及對照品比對[9]，推斷化合物31為酪氨酸，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖12、圖13。

圖12 酪氨酸二級質(zhì)譜圖Figure 12 MS/MS spectrum for tyrosine

圖13 酪氨酸可能的裂解途徑Figure 13 Possible fragmentation path way for tyrosine

3.2.6 嘌呤類成分的鑒定及分析 嘌呤類成分質(zhì)譜碎片較少，可能由于分子量較小及結(jié)構(gòu)較多環(huán)合很難形成碎片離子，化合物32為地龍中典型的嘌呤類成分，其準(zhǔn)分子離子137[M+H]+可以失去1個H2O形成119[M+H-H2O]+碎片離子，準(zhǔn)分子也可發(fā)生開環(huán)失去CHN并發(fā)生重排反應(yīng)形成110[M+H-CHN]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及標(biāo)準(zhǔn)品比對，推斷化合物32為次黃嘌呤，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖14、圖15。

圖14 次黃嘌呤二級質(zhì)譜圖Figure 14 MS/MS spectrum for 6-hydroxypurine

圖15 次黃嘌呤可能的裂解途徑Figure 15 Possible fragmentation path way for 6-hydroxypurine

3.2.7 香豆素類成分的鑒定及分析 化合物35為知母中香豆素類成分，其準(zhǔn)分子離子287[M+H]+失去支鏈形成豐度最高的203[M+H-C5H8O]+碎片離子，此碎片離子發(fā)生五元環(huán)開環(huán)反應(yīng)并同時失去O形成147[M+H-C5H8O-C2O2]+碎片離子，147碎片離子進一步失去O形成131[M+H-C5H8O-C2O3]+碎片離子，也可失去CO形成119[M+H-C5H8O-C2O2-CO]+碎片離子。根據(jù)裂解方式及對照品比對，推斷化合物35為氧化前胡素，其二級質(zhì)譜、裂解可能途徑分別見圖16、圖17。

圖16 氧化前胡素二級質(zhì)譜圖Figure 16 MS/MS spectrum for oxypeucedanin

圖17 氧化前胡素可能的裂解途徑Figure 17 Possible fragmentation path way for oxypeucedanin

4 討論

藥效學(xué)研究表明，平喘顆粒具有較好的鎮(zhèn)咳、祛痰、抗急（慢）性炎癥、抗疲勞、抗乏氧、提高免疫力、平喘作用[10]；能減輕哮喘后的炎癥反應(yīng)，抑制細胞自噬信號通路[11]，改善和控制氣道重塑過程中氣道高反應(yīng)和氣道阻塞的狀態(tài)，并可抑制EGF mRNA的表達[12]，從而保護肺部組織細胞，減輕哮喘發(fā)作。平喘顆粒還可以保護16HBE細胞，降低其凋亡率、自噬數(shù)量，抑制Caspase-3以及Beclin-1的表達[13]；可以抑制Akt、mTOR的磷酸化，從而抑制自噬的發(fā)生，可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)[14]。

本研究采用HPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)，首次對平喘顆粒的化學(xué)成分進行了系統(tǒng)研究，鑒定或推斷了平喘顆粒中35個化合物的結(jié)構(gòu)，包括15個黃酮類、4個生物堿類、4個木脂素類、6個有機酸類、2個氨基酸類、3個嘌呤類、1個香豆素類化合物。當(dāng)中的部分成分具有顯著的生物活性，如蘆丁和芒柄花素能夠抑制氣道炎癥與重塑的作用[15-16]，毛蕊異黃酮和槲皮素能減輕哮喘炎癥反應(yīng)[17-19]，木犀草素和五味子醇甲可以減少氣道高反應(yīng)性、降低氣道阻力、減少黏液過多的分泌、減少炎性細胞對肺組織的浸潤[20-21]，異鼠李素具有抑制炎癥反應(yīng)、修復(fù)肺組織、減輕組織損傷的作用[22]，五味子乙素能夠逆轉(zhuǎn)因哮喘導(dǎo)致的氣道壁厚度增加的趨勢、起到減輕病情的作用[23]，亞油酸可以抑制哮喘狀況下過分活躍的免疫系統(tǒng)、減輕免疫損傷的發(fā)生[24]，等等。

本研究分析鑒定了平喘顆粒中35個化合物的結(jié)構(gòu)，以黃酮類、生物堿類、有機酸類等為主，這些化合物的結(jié)構(gòu)通過高分辨質(zhì)譜得到了初步的推斷，有助于系統(tǒng)了解平喘顆粒所含化學(xué)成分，并為活性成分的定向提取分析及質(zhì)量控制方法的建立提供借鑒，也可以為組方中各藥味所含化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解途徑研究提供借鑒和參考。