劉靜，謝朋飛，蔡延渠

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖南郴州 423000；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東廣州 510006；3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑實(shí)驗(yàn)室（三級(jí)），廣東廣州 510006；4.廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

2009年國(guó)務(wù)院頒布的《全國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009－2020年）》中提出，到2020年，全國(guó)茶油產(chǎn)量將達(dá)250多萬噸、年產(chǎn)值近千億元[1]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示[2]，2019年我國(guó)油茶籽年產(chǎn)量已達(dá)262萬噸，以湖南、江西、廣西為主產(chǎn)區(qū)。在選取油茶籽進(jìn)行榨油后，殘余的巨量油茶果殼多作為廢料進(jìn)行焚燒等處理，造成極大的資源浪費(fèi)與環(huán)境污染。

茶皂素是五環(huán)三萜類皂苷化合物，由糖體、酸基等結(jié)合而成。茶皂素具有廣泛的功能作用與生物活性[3-6]，如表面活性劑（發(fā)泡、乳化等）、溶血作用、抗菌、抗氧化、抗炎、抗高血壓、抗癌、降脂、殺蟲驅(qū)蟲等。本課題組前期在研究油茶果殼多糖的過程發(fā)現(xiàn)，其提取物在提取、濃縮過程中發(fā)泡現(xiàn)象十分明顯，結(jié)合相關(guān)研究資料[7-8]，推測(cè)其茶皂素含量較高，值得進(jìn)一步的研究。因此，本文擬對(duì)油茶果殼中茶皂素進(jìn)行抗菌活性評(píng)價(jià)及作用機(jī)制的初步分析，為油茶果殼的多元化利用和高附加值轉(zhuǎn)化進(jìn)行探索，并進(jìn)一步明確油茶果殼茶皂素抑殺臨床常見致病菌的可行性，為研發(fā)低毒有效的抗菌劑或抗菌增效劑提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

ATCC 1228表皮葡萄球菌（Staphylococcus Epi‐dermidis）、ATCC 6538金黃色葡萄球菌（Staphylococ‐cus aureus）、ATCC 700603肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）、ATCC 49103變形桿菌（Proteus vul‐garis）、ATCC 14028沙門氏菌（Salmonella）、ATCC 9027銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、ATCC 8739大腸桿菌（Escherichia coli）、ATCC 43300福氏痢疾桿菌（Shigella flexneri），均來源于廣東省微生物研究所。

1.2 試藥

茶皂素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>90.0%），課題組自制；鹽酸環(huán)丙沙星粉（USA）；環(huán)丙沙星藥敏片（10 μg/片，杭州天和微生物試劑有限公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：1094671，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；M-H瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20200516，青島海博生物技術(shù)有限公司）；羅丹明123（上海源葉生物科技有限公司）；堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒（南京建成生物工程有限公司）。

1.3 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化科技設(shè)備有限公司）；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HHS2-4型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LX-B50L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華素醫(yī)療設(shè)備有限公司）；iMark酶標(biāo)儀、IQ5型熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）。

2 方法

2.1 藥液配制

稱取一定質(zhì)量的茶皂素粉末于容量瓶中，加入純水定容，配制成質(zhì)量濃度為50.0 mg/mL的貯備液，再按照對(duì)半稀釋法依次稀釋成25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098、0.049 mg/mL的系列濃度樣品溶液；同法以水溶解環(huán)丙沙星粉末，配制成質(zhì)量濃度為50.0、25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098、0.049 μg/mL的系列濃度陽性對(duì)照溶液，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌液制備

將表皮葡萄球菌等菌株于-70℃冰箱中取出，在M-H瓊脂板上劃線，37℃培養(yǎng)20 h，挑取形態(tài)良好的單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18~20 h，取出后搖勻，采用比濁管進(jìn)行比對(duì)，調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋?×108CFU/mL），再進(jìn)一步稀釋至1×106CFU/mL，冰箱4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 茶皂素的體外抗菌活性測(cè)定

2.3.1 抑菌環(huán)直徑測(cè)定 參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行操作。采用K-B紙片法，吸取質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的茶皂素溶液5 μL于6.0 mm紙片上，烘箱50℃烘干，制成每片含50 μg茶皂素的藥敏片。吸取濃度為1×106CFU/mL的菌液0.1 mL，于M-H瓊脂板上涂布均勻，稍晾干，將茶皂素、環(huán)丙沙星藥敏片貼放于菌板上，37℃倒置培養(yǎng)20 h，取出用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑。每個(gè)樣品平行3份。

2.3.2 MIC及MBC測(cè)定 參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行操作。采用微量稀釋法，吸取“2.1”項(xiàng)下不同濃度茶皂素溶液各100 μL于96孔板中（每排的第1~11孔），再依次加入1×106CFU/mL的菌液100 μL，混勻，使得孔中茶皂素終質(zhì)量濃度依次為25.0、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098、0.049、0.024 mg/mL；第12孔加入無菌純水和菌液各100 μL，作為陰性對(duì)照。加樣后，將96孔板37℃培養(yǎng)20 h，取出觀察孔中有無細(xì)菌生長(zhǎng)，判定MIC；同時(shí)選擇茶皂素質(zhì)量濃度為MIC、2MIC、4MIC的菌懸液，分別吸取20μL于M-H瓊脂板上涂勻，37℃培養(yǎng)18～20 h，取出觀察計(jì)數(shù)，以≤5個(gè)菌落數(shù)者為MBC。同法測(cè)定環(huán)丙沙星陽性對(duì)照溶液的MIC及MBC。

2.4 茶皂素的抗菌作用機(jī)制研究

根據(jù)活性評(píng)價(jià)結(jié)果，選取革蘭陽性菌——金黃色葡萄球菌、革蘭陰性菌——福氏痢疾桿菌為代表進(jìn)行抗菌作用機(jī)制的初步研究。實(shí)驗(yàn)主要參考文獻(xiàn)[10-12]操作，并進(jìn)行適當(dāng)改變。

2.4.1 茶皂素對(duì)致病菌生長(zhǎng)特性的影響 設(shè)置茶皂素不同質(zhì)量濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對(duì)照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質(zhì)量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對(duì)照組中只加入同量的無菌純水和菌液。放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，于24 h內(nèi)每隔2 h取出混合培養(yǎng)液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光度（A600）值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)抑制曲線，考察不同濃度茶皂素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同受試菌株生長(zhǎng)的影響。

2.4.2 茶皂素對(duì)致病菌細(xì)胞壁通透性的影響 設(shè)置茶皂素不同濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對(duì)照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質(zhì)量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對(duì)照組中只加入同量的無菌純水和菌液。放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12 h，每隔2 h將混合培養(yǎng)液取出，6 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書上的操作測(cè)定AKP活性，考察不同濃度茶皂素對(duì)不同受試菌株細(xì)胞壁通透性的影響。

2.4.3 茶皂素對(duì)致病菌細(xì)胞膜電位的影響 設(shè)置茶皂素不同濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對(duì)照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質(zhì)量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對(duì)照組中只加入無菌純水和菌液。放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，于0、2、4、6、8 h取出混合培養(yǎng)液，6 000 r/min低溫離心15 min，收集菌體沉淀物，用0.01 mol/L的PBS緩沖液沖洗3次，再加入終質(zhì)量濃度為2 μg/mL的羅丹明123，放置陰暗處避光反應(yīng)0.5 h，然后繼續(xù)用0.01 mol/L的PBS緩沖液對(duì)處理后的菌液沖洗3次，采用熒光分光光度計(jì)，在激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm條件下測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度，考察不同濃度茶皂素對(duì)不同受試菌株細(xì)胞膜電位的影響。

2.4.4 茶皂素對(duì)致病菌細(xì)胞內(nèi)溶物的影響 設(shè)置茶皂素不同濃度組（1/2MIC、MIC、2MIC）、空白對(duì)照組，茶皂素組中分別加入一定濃度藥液和菌液，使其混合液終質(zhì)量濃度為1/2MIC、MIC、2MIC；空白對(duì)照組中只加入無菌純水和菌液。放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6 h，取出混合培養(yǎng)液，6 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定A260值，考察不同濃度茶皂素對(duì)不同受試菌株細(xì)胞內(nèi)核酸含量的影響；同時(shí)按照BCA試劑盒說明書上的操作測(cè)定蛋白質(zhì)含量，考察不同濃度茶皂素對(duì)不同受試菌株細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 茶皂素的體外抗菌活性評(píng)價(jià)

茶皂素對(duì)受試菌株的抑菌環(huán)直徑范圍為10.86~17.31 mm，MIC值范圍為0.20~1.56 mg/mL，MBC值范圍為0.39~3.13 mg/mL；環(huán)丙沙星對(duì)受試菌株的抑菌環(huán)直徑范圍為23.88~31.56 mm，MIC值范圍為0.78~3.12 μg/mL，MBC值范圍為1.56~6.25 μg/mL，見表1?？芍柙硭貙?duì)表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的敏感性最強(qiáng)，其次為變形桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、福氏痢疾桿菌，最弱為肺炎克雷伯菌、大腸桿菌。抑菌環(huán)直徑的敏感性高低與MIC值的抑制作用強(qiáng)弱表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。與抗生素環(huán)丙沙星相比，茶皂素對(duì)所有受試菌株的抑菌環(huán)直徑、MIC、MBC差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明茶皂素的抗菌作用弱于環(huán)丙沙星。

表1 8種致病菌株的體外抑菌活性Table 1 In vitro antibacterial activity of 8 pathogenic strains(n=3)

3.2 茶皂素的抗菌作用機(jī)制評(píng)價(jià)

3.2.1 茶皂素對(duì)致病菌的生長(zhǎng)抑制曲線 不同濃度茶皂素在不同時(shí)間點(diǎn)作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌后的A600值，變化趨勢(shì)見圖1。金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌，空白組（水）分別在培養(yǎng)8 h、6 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，1/2MIC、MIC茶皂素組分別在10 h、6 h和20 h、20 h開始呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；而2MIC茶皂素組則在24 h內(nèi)基本不增長(zhǎng)。結(jié)果顯示，茶皂素在1/2MIC濃度時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌的正常生長(zhǎng)繁殖稍有影響，而當(dāng)濃度增加至MIC、2MIC時(shí)，能夠顯著地抑制其生長(zhǎng)（P<0.01），抑制作用強(qiáng)弱與藥物濃度及作用時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)。

3.2.2 茶皂素對(duì)致病菌的細(xì)胞壁通透性的影響 不同濃度茶皂素在不同時(shí)間點(diǎn)作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌后的培養(yǎng)液中AKP含量，變化趨勢(shì)見圖2。對(duì)于金黃色葡萄球菌和福氏痢疾桿菌空白組，其胞外的AKP含量均極低，當(dāng)茶皂素濃度為1/2MIC時(shí)，胞外AKP含量略微增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而隨著濃度增加至MIC、2MIC時(shí)，2種受試菌株的細(xì)胞壁均受到明顯的破壞，因此導(dǎo)致胞外AKP含量均明顯增加（P<0.01）。結(jié)果亦顯示，隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞壁受損程度越大，細(xì)菌胞外的AKP含量越多，具正相關(guān)。

圖2 不同濃度茶皂素對(duì)受試菌株細(xì)胞外AKP含量的影響Figure 2 Effects of different concentrations of tea saponin on extracellular AKP content of tested strains

3.2.3 茶皂素對(duì)致病菌的細(xì)胞膜電位的影響 不同濃度茶皂素在不同時(shí)間點(diǎn)作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌后的菌液熒光強(qiáng)度，變化趨勢(shì)見圖3。未加入茶皂素前，兩種受試菌菌液的熒光強(qiáng)度均基本保持平衡，隨著時(shí)間變化略微上升；加入1/2MIC的茶皂素后，熒光強(qiáng)度稍有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)增大濃度至MIC、2MIC時(shí)，金黃色葡萄球菌的菌液熒光強(qiáng)度在2 h內(nèi)由354.52 AU、350.86 AU分別快速下降至91.92 AU與73.82 AU，福氏痢疾桿菌的菌液熒光強(qiáng)度在2 h內(nèi)由394.84 AU、385.81 AU分別快速下降至121.54 AU與76.10 AU，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。主要是由于細(xì)胞膜完整性受到嚴(yán)重破壞，引起跨膜電位下降，細(xì)胞發(fā)生去極化，親脂性陽離子物質(zhì)羅丹明123從細(xì)胞中釋放出來，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著性降低。結(jié)果表明茶皂素能夠有效影響菌體細(xì)胞的代謝活動(dòng)，從而破壞其正常生長(zhǎng)繁殖。

圖3 不同濃度茶皂素對(duì)受試菌株細(xì)胞膜電位的影響Figure 3 Effects of different concentrations of tea saponin on cell membrane potential of tested strains

3.2.4 茶皂素對(duì)致病菌的細(xì)胞內(nèi)容物的影響 不同濃度茶皂素在作用于金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌6 h后的細(xì)胞外核酸和可溶性蛋白質(zhì)含量，比較結(jié)果見圖4~圖5。空白組（水）隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞正常生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞內(nèi)特有物質(zhì)——核酸（如DNA、RNA等）、蛋白質(zhì)等的含量亦隨著上升；當(dāng)加入茶皂素至1/2MIC時(shí)，對(duì)細(xì)胞膜未產(chǎn)生明顯的破壞作用，因此胞外核酸、蛋白質(zhì)含量無顯著性提高（P>0.05）；而當(dāng)2MIC加入茶皂素至MIC、2MIC時(shí)，藥物濃度的增加引起細(xì)菌細(xì)胞膜的破裂，內(nèi)容物溢出，因此導(dǎo)致胞外核酸、蛋白質(zhì)含量的顯著性上升（P<0.01）。結(jié)果表明，茶皂素具有破壞受試菌株細(xì)胞膜完整性的作用，且表現(xiàn)濃度依賴性。

圖4 不同濃度茶皂素對(duì)受試菌株細(xì)胞外核酸含量的影響Figure 4 Effects of different concentrations of tea saponin on extracellular nucleic acid content of tested strains

圖5 不同濃度茶皂素對(duì)受試菌株細(xì)胞外可溶性蛋白含量的影響Figure 5 Effects of different concentrations of tea saponin on the content of extracellular soluble protein of tested strains

4 討論

目前，在臨床上出現(xiàn)越來越多的致病菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致現(xiàn)有的抗菌藥物正逐步失效、甚至無效，迫切需要開發(fā)出新的抗菌劑或通過相關(guān)技術(shù)方法提升現(xiàn)有藥物的抗菌活性。本文利用油茶果殼為原料制備出高純度的茶皂素，通過體外抗菌活性評(píng)價(jià)，明確其對(duì)表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的抗菌作用最強(qiáng)（抑菌環(huán)直徑為16.32 mm、15.63 mm，MIC均為0.39 mg/mL、MBC均為0.78 mg/mL）；抗菌作用機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)茶皂素濃度達(dá)到MIC、2MIC時(shí)，能夠破壞金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，引起細(xì)胞內(nèi)容物AKP、核酸、蛋白質(zhì)的滲出及降低細(xì)胞膜電位，影響菌體細(xì)胞的正常代謝，同時(shí)進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抑制其生長(zhǎng)的作用，并且作用強(qiáng)度與藥物濃度成正相關(guān)。

雖然與現(xiàn)有抗生素相比，茶皂素在體外的抗菌作用仍較弱，但是其原料（油茶籽、油茶果殼等）來源十分豐富，因此生產(chǎn)成本低廉，同時(shí)還具備無殘留、無毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥性、抗菌譜廣等優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步開展更為系統(tǒng)全面的體內(nèi)外抗菌活性、聯(lián)合用藥等評(píng)價(jià)，為其開發(fā)為天然抗菌劑或抗菌增效劑奠定基礎(chǔ)，從而有望廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖、醫(yī)藥衛(wèi)生、化妝品及日用品等領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)降抗、替抗愿景。