洪杰，盧雅明，龔春華，賁永光

（1.華南理工大學(xué)校醫(yī)院，廣東廣州 510641；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAP）是脊椎動(dòng)物骨骼和牙齒等硬組織中廣泛存在的無機(jī)成分，具有良好的生物相容性和生物活性，無毒無刺激，有望成為理想的脊椎動(dòng)物硬組織的口腔醫(yī)學(xué)材料，在口腔醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道了多種制備HAP的方法。相比于其他方法，超聲化學(xué)法由于其高效、綠色環(huán)保的特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。殼聚糖（chitosan，CS）是一種具有良好的生物相容性、可生物降解的天然堿性多糖，且具有一定黏性，能改善HAP材料本身脆性較大、強(qiáng)度小的問題［5-6]。兩者結(jié)合的HAP/CS復(fù)合材料性能優(yōu)異，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注，但多數(shù)研究主要集中在藥物載體和骨組織工程方面［1,7-8]，應(yīng)用在口腔臨床上的研究鮮見報(bào)道。

本文采用超聲輔助化學(xué)沉淀法、反相乳化交聯(lián)法制備分散性良好的納米HAP和HAP/CS復(fù)合微球，并采用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）、X線粉末衍射法（XRD）、掃描電鏡（SEM）進(jìn)行表征，為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用在牙齒抗菌和填充等方面的制劑提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

FA2004型電子天平（上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司）；TDL-60B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LX0211型馬弗爐（天津市波特瑞儀器設(shè)備有限公司）；UV-5500PC型紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Empyrean型X線粉末衍射儀（德國Bruker公司）；FT/IR-480·Plus型傅里葉變換紅外光譜儀（日本Jasco公司）；Merlin型場發(fā)射掃描電鏡（德國蔡司公司）。

Ca（NO3）2·4H2O（海麥克林生化科技有限公司）；（NH4）2HPO4（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；殼聚糖（上海麥克林生化科技有限公司）；其余均為分析純。

2 方法

2.1 羥基磷灰石（HAP）的制備及表征

采用超聲輔助化學(xué)沉淀法，在控制Ca（NO3）2·4H2O和（NH4）2HPO4的Ca/P摩爾比值為1.67的條件下制備納米羥基磷灰石。稱取7.080 g Ca（NO3）2·4H2O、2.381 g（NH4）2HPO4放入燒杯中，分別溶解在60 mL去離子水中，配制成0.5 mol/L的Ca（NO3）2溶液和0.3 mol/L的（NH4）2HPO4溶液，2種溶液均用氨水調(diào)節(jié)pH值至10[9]。在40℃、600 r/min的磁力攪拌條件下，用分液漏斗將（NH4）2HPO4溶液恒速逐滴加入Ca（NO3）2溶液中，反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)至超聲器皿，超聲分散45 min，陳化24 h。將溶液倒出，在轉(zhuǎn)速為2 000 r/min下離心1 min，倒掉上層清液，用去離子水和無水乙醇各洗滌3次。將沉淀物在80℃烘干，研磨，馬弗爐700℃煅燒2 h，即得HAP粉體，采用FTIR、XRD及SEM對(duì)其結(jié)晶結(jié)構(gòu)及組成進(jìn)行分析。

2.2 不同質(zhì)量比的HAP/CS復(fù)合微球的制備及表征

采用反相乳化交聯(lián)法制備HAP/CS復(fù)合微球，考察不同質(zhì)量比的HAP∶CS對(duì)HAP/CS復(fù)合微球形貌的單因素影響。將25 mL液狀石蠟（含體積分?jǐn)?shù)為3%司盤-80）倒入燒杯內(nèi)，燒杯置于恒溫機(jī)械攪拌水浴鍋中，溫度設(shè)為50℃，攪拌混勻[10-11]。稱取CS粉末0.15 g，充分溶解于5 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的冰乙酸水溶液中，分別加入不同質(zhì)量的羥基磷灰石粉末（HAP∶CS的質(zhì)量比為70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70），攪拌超聲混合后逐滴加入燒杯內(nèi)。在一定的速度下磁力攪拌1 h后，得到白色乳液。然后緩慢加入25%戊二醛0.6 mL，繼續(xù)攪拌1 h后進(jìn)行交聯(lián)固化。將黃褐色反應(yīng)液倒出，在轉(zhuǎn)速2 000 r/min下離心1 min后，倒掉上層液體，再依次用異丙醇、石油醚、無水乙醇各洗滌3次。將黃褐色沉淀放入烘箱中60℃烘干，即得HAP/CS復(fù)合微球，采用FTIR、XRD及SEM對(duì)HAP/CS復(fù)合微球進(jìn)行表征。

3 結(jié)果與分析

3.1 FTIR表征結(jié)果

3.1.1 HAP的FTIR表征結(jié)果

由圖1可知，474、571、601 cm-1是P-O的彎曲振動(dòng)吸收峰，而出現(xiàn)在1 040、1 090 cm-1的強(qiáng)譜帶和962 cm-1吸收峰是P-O的伸縮振動(dòng)吸收峰，由這2處吸收峰可初步判定樣品中含有PO43-，證實(shí)HAP經(jīng)過馬弗爐高溫煅燒后結(jié)晶性較強(qiáng)。875、1 387、1 457 cm-1是CO32-振動(dòng)吸收峰，其中1 387 cm-1和1 457 cm-1處出現(xiàn)的雙峰，是CO32-進(jìn)入磷灰石結(jié)構(gòu)的重要標(biāo)志，可以說明HAP粉體中PO43-結(jié)構(gòu)固溶有部分CO32-結(jié)構(gòu)，CO32-的存在是由于粉體在合成、陳化過程中吸收了空氣中少量的CO2。3 571 cm-1處是O-H的對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，1 651 cm-1處是水分子的彎曲振動(dòng)吸收峰。以上結(jié)果表明：制備的樣品中含有和OH-，證明合成了羥基磷灰石。

圖1 HAP的FTIR光譜圖Figure 1 FTIR spectrum of HAP

3.1.2 CS的FTIR表征結(jié)果

由圖2可知，3 540 cm-1是OH-1和?NH2伸縮振動(dòng)的重疊峰，1 663、1 567、1 322 cm-1是酰胺Ⅰ譜帶特征峰（即C=O的伸縮振動(dòng)），酰胺Ⅱ譜帶特征峰（?NH2變形振動(dòng)吸收峰）和酰胺Ⅲ譜帶特征峰[12]，1 377 cm-1是酰胺Ⅲ譜帶和?CH2搖晃振動(dòng)吸收峰，C?O不對(duì)稱的伸縮振動(dòng)吸收峰在1 153、1 420 cm-1是?CH2變形振動(dòng)和?CH3彎曲振動(dòng)的吸收峰，1 072、1 032 cm-1處是C?O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。

圖2 CS的FTIR光譜圖Figure 2 FTIR spectrum of CS

3.1.3 HAP/CS復(fù)合微球的FTIR表征結(jié)果

從圖3可知，3 571 cm-1處吸收峰表明HAP的O-H特征峰仍然存在，且在復(fù)合后峰的強(qiáng)度變大，原本CS中1 663 cm-1酰胺Ⅰ譜帶特征峰發(fā)生紅移至1 671 cm-1、且強(qiáng)度增強(qiáng)。?C?O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰從1 153 cm-1藍(lán)移至1 089 cm-1，而對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰在1 072 cm-1與1 032 cm-1發(fā)生藍(lán)移且合并為1個(gè)移動(dòng)峰1 045 cm-1，強(qiáng)度有所增強(qiáng)。結(jié)果顯示，HAP和CS結(jié)合成復(fù)合微球后發(fā)生相互作用，HAP/CS復(fù)合微球與HAP、CS的一些特征吸收峰發(fā)生重合[8]且沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，證明合成了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HAP/CS復(fù)合微球。

圖3 HAP/CS復(fù)合微球的FTIR光譜Figure 3 FTIR spectrum of HAP/CS composite microspheres

3.2 XRD表征結(jié)果

根據(jù)JCPDS標(biāo)準(zhǔn)卡片PDF-09-0432進(jìn)行XRD衍射標(biāo)準(zhǔn)譜分析，進(jìn)一步研究HAP/CS復(fù)合微球的成分和結(jié)晶性。由圖4（A）可知，HAP產(chǎn)物在2θ為25.9°、31.7°、32.2°、32.8°、39.7°、46.7°、49.4°、53.1°處出現(xiàn)了羥基磷灰石的幾個(gè)特征衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于HAP晶體（002）、（211）、（112）、（300）、（310）、（222）、（213）、（004）的晶面特征衍射，與納米羥基磷灰石的標(biāo)準(zhǔn)圖譜基本相同，其中（002）、（211）、（300）為羥基磷灰石的主要衍射峰，峰形明銳，半高寬小，表明結(jié)晶性好，衍射峰寬說明得到了粒徑較小的顆粒，表明采用超聲輔助化學(xué)沉淀法可以制備出結(jié)晶度高的羥基磷灰石。由圖4（B）可知，在2θ為19.8°和20.1°處出現(xiàn)殼聚糖的特征衍射峰。由圖4（C）可知，HAP/CS復(fù)合微球的衍射圖譜中出現(xiàn)了HAP和CS特征衍射峰，其中CS的衍射峰強(qiáng)度在復(fù)合微球圖譜中弱化了的原因是CS呈無定形狀態(tài)，在使用反相乳化交聯(lián)法與羥基磷灰石交聯(lián)后，HAP鑲嵌在表面或者改變了CS結(jié)晶形態(tài)，降低了CS的結(jié)晶度。對(duì)比圖4（A），HAP/CS復(fù)合微球的衍射圖譜中HAP的特征衍射峰的峰形仍然比較明顯，但強(qiáng)度明顯減弱，表明復(fù)合微球中HAP的結(jié)晶性比HAP單體的結(jié)晶性低。以上結(jié)果顯示，HAP/CS復(fù)合微球含有HAP和CS 2種成分，且沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)。

圖4 HAP（A）、CS（B）、HAP/CS復(fù)合微球（C）的XRD衍射圖Figure 4 XRD diffraction patterns of HAP(A),CS(B),HAP/CS composite microspheres(C)

3.3 SEM表征結(jié)果

3.3.1 HAP的SEM表征結(jié)果

從圖5可知，制備的HAP呈類棒狀，顆粒大小在100 nm左右，團(tuán)聚粘連的現(xiàn)象較少，說明超聲輔助化學(xué)沉淀法可以制備出尺寸均勻的HAP。

圖5 HAP的SEM圖譜Figure 5 SEM spectra of HAP

3.3.2 HAP/CS的SEM表征結(jié)果

在水浴溫度為50℃、水油相比例為1∶5、乳化劑用量為油相的3%、交聯(lián)劑用量為0.6 mL的條件下，探索HAP∶CS不同質(zhì)量比對(duì)HAP/CS復(fù)合微球的形貌和分散性的影響，結(jié)果見圖6?？梢姡?dāng)HAP∶CS質(zhì)量比為7∶3時(shí)，合成的微球粒徑大小不一，微球都粘連在一起，存在大塊的團(tuán)聚物，分散性差，微球表面凹凸不平，分散著團(tuán)聚的HAP；隨著HAP的減少，微球的形貌逐漸變規(guī)則，粒徑趨向均勻，當(dāng)HAP∶CS質(zhì)量比為5∶5時(shí)，復(fù)合微球的球形更趨近規(guī)整，可以看到表面分散的HAP分散較為均勻，顆粒間較其他質(zhì)量比微球粘連性下降；當(dāng)HAP∶CS的質(zhì)量比為3∶7時(shí)，均一性下降，微球圓整度高，但微球表面HAP顆粒較少，且分布不均勻，出現(xiàn)大塊團(tuán)聚物[13]。原因可能是：由于HAP被吸附包埋在CS內(nèi)部，HAP含量比CS多的時(shí)候，兩者界面鍵合作用力較弱，HAP本身脆、強(qiáng)度差使微球成球性差。當(dāng)HAP和CS含量達(dá)到合適的比例時(shí)，CS之間的競爭減少，從而更有利于包裹固化形成形貌、粒徑尺寸均勻的微球；當(dāng)CS含量比HAP多的時(shí)候，HAP本身具有較高表面能，更容易發(fā)生團(tuán)聚，與CS的結(jié)合程度較差，形成的復(fù)合微球上面分布的HAP含量少且不均勻，HAP本身團(tuán)聚的時(shí)候，CS分子內(nèi)和分子間氫鍵難以形成，CS結(jié)晶度降低，導(dǎo)致復(fù)合微球大小不均，而且仍存在著沒有復(fù)合上去的HAP。

圖6 不同質(zhì)量比的HAP/CS復(fù)合微球的SEM圖譜Figure 6 SEM spectra of HAP/CS composite microspheres with different mass ratios

4 討論

采用超聲輔助化學(xué)沉淀法制備得到的HAP納米，晶體粒徑均勻，有少量團(tuán)聚，粒徑約為100 nm，屬于較小納米范圍，相比較傳統(tǒng)的化學(xué)沉淀法具有推廣意義。殼聚糖具有良好的生物相容性，采用反相乳化交聯(lián)法制備HAP/CS復(fù)合微球，在控制水油比、反應(yīng)溫度、乳化劑和交聯(lián)劑的用量情況下，改變HAP與CS的質(zhì)量比，通過FTIR、SEM和XRD表征手段可知能夠制備出大小在十幾微米到一百多微米的HAP/CS復(fù)合微球，其中當(dāng)HAP與CS的質(zhì)量比為5∶5時(shí)，能夠制備出較為均勻且較少雜質(zhì)的HAP/CS復(fù)合微球。本研究的主要目的是探究不同HAP含量對(duì)HAP/CS復(fù)合微球形貌的影響，因此只采用SEM法觀察形貌和顆粒大小，未對(duì)樣品進(jìn)行其他表征，今后將進(jìn)行相關(guān)的深入研究。

本研究制備的HAP/CS復(fù)合微球安全無毒、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，為進(jìn)一步探究HAP/CS復(fù)合微球在牙齒抗菌和填充等方面的應(yīng)用提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，在口腔醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。