李 偉，李宏偉，黃 勇，牛曉東，李鳳玉

中國人民解放軍陸軍第81集團(tuán)軍醫(yī)院:1.病理科;2.腫瘤科，河北張家口 075000

乳腺惡性葉狀腫瘤作為一種發(fā)病率極低的乳腺腫瘤疾病，分屬于乳腺分葉狀腫瘤，多發(fā)于中年女性患者，具有較高的生存率，但復(fù)發(fā)率較高[1-2]。乳腺惡性葉狀腫瘤臨床癥狀為單側(cè)無痛硬質(zhì)包塊，多數(shù)患者發(fā)病快，發(fā)病數(shù)周內(nèi)即可確診，少數(shù)患者腫瘤生長期漫長，可達(dá)多年[3]。干細(xì)胞蛋白Piwil樣蛋白2(Piwil2)屬于Piwi亞家族成員之一，在干細(xì)胞發(fā)育、自我更新、RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及誘導(dǎo)沉默中具有重要意義[4]。Piwil2可通過抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)癌癥的發(fā)生[5]，已有研究表明，Piwil2在乳腺癌組織中異常高表達(dá)[6]。B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)是一種抗凋亡蛋白，在線粒體外膜通過控制線粒體膜的通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)，除此之外，其在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要的作用[7]。已有研究表明，Bcl-2在結(jié)直腸癌組織中呈異常高表達(dá)狀態(tài)[8]。目前，關(guān)于Piwil2和Bcl-2與乳腺惡性葉狀腫瘤相關(guān)性的研究相對(duì)較少，因此本研究通過檢測(cè)Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤患者腫瘤組織中的表達(dá)情況，對(duì)二者與乳腺惡性葉狀腫瘤疾病的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為疾病的檢測(cè)及術(shù)后復(fù)發(fā)情況提供研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年9月至2015年10月中國人民解放軍第81集團(tuán)軍醫(yī)院確診的30例乳腺惡性葉狀腫瘤患者作為乳腺惡性葉狀腫瘤組，平均年齡(41.31±13.54)歲；月經(jīng)15例，無月經(jīng)15例；年齡≥45歲有17例，年齡<45歲有13例；腫瘤最大徑<5 cm有10例，腫瘤最大徑≥5 cm有20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；腫瘤部位：左乳16例，右乳14例。30例患者腫瘤均原發(fā)于乳腺，為無痛性包塊且病程多為2周至3年。另選取同期32例乳腺纖維腺瘤患者作為對(duì)照組，平均年齡(42.65±12.11)歲；月經(jīng)15例，無月經(jīng)17例；年齡≥45歲有16例，<45歲有16例；腫瘤最大徑<5 cm有12例，腫瘤最大徑≥5 cm有20例；腫瘤部位：左乳17例，右乳15例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者和家屬均知情并簽署同意書。

乳腺惡性葉狀腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《WHO乳腺腫瘤分類》[9]中的相關(guān)內(nèi)容：核分裂象≥10HPF，組織細(xì)胞異質(zhì)性明顯，浸潤性邊界，出現(xiàn)惡性異源性成分，間質(zhì)過度增生。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)活檢等手段檢查確診，臨床資料完整；(2)進(jìn)行手術(shù)切除治療，術(shù)前未進(jìn)行其他輔助性治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)在近期進(jìn)行過化療或手術(shù)等治療；(2)患其他惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病；(3)未經(jīng)明確病理診斷確診；(4)臨床資料不完整。

1.2儀器及試劑 兔抗人Piwil2多克隆抗體(批號(hào)：PAB27177)購自武漢艾美捷科技有限公司；Bcl-2多克隆抗體(批號(hào)：PAB8567)購自上海群己生物科技有限公司；即用型SP免疫組化試劑盒(批號(hào)：CDJ-1593C-SJH)購自武漢純度生物科技有限公司；顯微鏡(型號(hào)：CI-POL)購自日本尼康公司。

1.3研究方法

1.3.1標(biāo)本采集 對(duì)照組術(shù)中取乳腺纖維腺瘤組織，乳腺惡性葉狀腫瘤組患者取手術(shù)切除腫瘤組織作為標(biāo)本。生理鹽水清理各組織標(biāo)本，甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片(5 μm)。

1.3.2免疫組化法檢測(cè)Piwil2、Bcl-2表達(dá) 將上述石蠟切片使用二甲苯進(jìn)行脫蠟、水化后采用磷酸鹽緩沖鹽溶液沖洗5 min。根據(jù)試劑盒說明書采用SP法染色，再用蘇木精復(fù)染、重新水化后封片進(jìn)行觀察。

結(jié)果判定如下[10]，根據(jù)染色強(qiáng)度：未染色記為0分，弱陽性染色記為1分，中等陽性染色記為2分，強(qiáng)陽性染色記為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞占比：陽性細(xì)胞占比≤25%為0分，25%<陽性細(xì)胞占比≤50%為1分，50%<陽性細(xì)胞占比≤75%為2分，陽性細(xì)胞占比>75%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分乘積即染色指數(shù)(SI)：陰性(-)，SI≤1；弱陽性(+)，1

1.4隨訪 對(duì)出院患者進(jìn)行為期5年的隨訪，截止時(shí)間為患者復(fù)發(fā)時(shí)間或至2020年10月，以電話或復(fù)查形式記錄患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman分析Piwil2和Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性；采用COX回歸分析影響乳腺惡性葉狀腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Piwil2、Bcl-2在對(duì)照組和乳腺惡性葉狀腫瘤組組織中的表達(dá)情況 Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組中的陽性率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1、2。

表1 Piwil2在對(duì)照組和乳腺惡性葉狀腫瘤組組織中的表達(dá)情況[n或n(%)]

表2 Bcl-2在對(duì)照組和乳腺惡性葉狀腫瘤組組織中的表達(dá)情況[n或(%)]

2.2乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性 在30例乳腺惡性葉狀腫瘤患者中，有17例患者Piwil2、Bcl-2均為陽性表達(dá)，有8例患者均為陰性表達(dá)；有3例患者Piwil2呈陽性表達(dá)而Bcl-2呈陰性表達(dá)，有2例患者Bcl-2呈陽性表達(dá)而Piwil2呈陰性表達(dá)。結(jié)果顯示，乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2的表達(dá)有一定關(guān)系(P<0.05)。見表3。

表3 乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性(n)

2.3Piwil2、Bcl-2表達(dá)情況與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2的表達(dá)在不同月經(jīng)情況、不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤部位患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺惡性葉狀腫瘤患者組織中Piwil2、Bcl-2陽性率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺惡性葉狀腫瘤患者組織(P<0.05)。見表4。

表4 Piwil2、Bcl-2表達(dá)情況與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.4乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系 經(jīng)過5年隨訪后，30例乳腺惡性葉狀腫瘤患者中有8例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為26.67%。Piwil2陰性患者和陽性患者復(fù)發(fā)率分別為0.00%(0/10)、40.00%(8/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.138，P=0.042)；Bcl-2陰性患者和陽性患者復(fù)發(fā)率分別為0.00%(0/11)、42.11%(8/19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.346，P=0.037)。

2.5COX回歸分析影響乳腺惡性葉狀腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的因素 單因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Piwil2和Bcl-2陽性表達(dá)均對(duì)乳腺惡性葉狀腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)存在影響(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Piwil2陽性表達(dá)和Bcl-2陽性表達(dá)均是影響患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

續(xù)表4 Piwil2、Bcl-2與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

表5 COX回歸分析影響乳腺惡性葉狀腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的因素

3 討 論

乳腺惡性葉狀腫瘤是一種極為少見的惡性腫瘤，其起源于小葉內(nèi)或?qū)Ч苤車g質(zhì)，僅占原發(fā)性乳腺腫瘤的0.9%，而復(fù)發(fā)率約為30%[11-12]。乳腺惡性葉狀腫瘤的發(fā)生機(jī)制至今尚未研究清楚，其病理特征常表現(xiàn)為組織細(xì)胞異質(zhì)性明顯、浸潤性邊界、出現(xiàn)惡性異源性成分、間質(zhì)過度增生，常出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移情況[13-14]。雖然乳腺惡性葉狀腫瘤發(fā)病率較低，但其造成的死亡多發(fā)生在確診后5年內(nèi)，而且其復(fù)發(fā)仍是臨床一大難題，因此嚴(yán)重威脅人們的生命健康和生活質(zhì)量。本研究通過檢測(cè)Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤患者腫瘤組織中的表達(dá)情況，對(duì)二者與乳腺惡性葉狀腫瘤疾病的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為疾病檢測(cè)、臨床特征分析及預(yù)后復(fù)發(fā)等情況提供信息依據(jù)。

Piwi家族在多種生物中表現(xiàn)高度保守，并且在多種人類癌癥中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)，Piwil2則屬于Piwi亞家族成員之一[15-16]。有研究表明，piR-932/Piwil2免疫共沉淀復(fù)合物的增加通過降低血小板生成素的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。Piwil2過表達(dá)激活內(nèi)源性RNA，增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)/B淋巴細(xì)胞瘤-xL(Bcl-xL)、STAT3/CynlinD1信號(hào)通路，從而參與腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Piwil2在乳腺癌組織中陽性率明顯高于癌旁組織，說明Piwil2可能調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[6]。本研究結(jié)果表明，Piwil2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的陽性率明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，與上述結(jié)果相一致，這表明Piwil2可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路參與乳腺惡性葉狀腫瘤的發(fā)生過程。

有報(bào)道稱，Bcl-2可通過延長腫瘤細(xì)胞生存期達(dá)到抑制其凋亡的作用，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18-19]。還有研究表明，Bcl-2通過增強(qiáng)上皮間質(zhì)中堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(Twist1)在轉(zhuǎn)化中的作用從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[20]。Bcl-2已被報(bào)道在多種癌組織中異常高表達(dá)[21]，肖曉嵐等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在乳腺葉狀腫瘤組織中表達(dá)明顯增加，并隨腫瘤的惡性程度增加而明顯增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的陽性率明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，這表明Bcl-2可能通過抑制細(xì)胞凋亡參與乳腺惡性葉狀腫瘤的發(fā)生過程。還有研究報(bào)道稱，Piwil2通過上調(diào)STAT3和Bcl-2基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G0/G1到S期的轉(zhuǎn)變及核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的增殖[5]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2的表達(dá)存在一定關(guān)系，表明Piwil2、Bcl-2可能通過相互作用共同促進(jìn)乳腺惡性葉狀腫瘤的發(fā)生。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2陽性率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺惡性葉狀腫瘤組織，且二者陽性表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者術(shù)后復(fù)發(fā)率升高。多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Piwil2陽性表達(dá)和Bcl-2陽性表達(dá)均是影響乳腺惡性葉狀腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示，Piwil2、Bcl-2可作為乳腺惡性葉狀腫瘤臨床監(jiān)測(cè)和預(yù)后復(fù)發(fā)情況的檢測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的陽性率明顯增加，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Piwil2陽性表達(dá)和Bcl-2陽性表達(dá)均是影響患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究為乳腺惡性葉狀腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究提供了依據(jù)，Piwil2、Bcl-2有作為乳腺惡性葉狀腫瘤臨床預(yù)后檢測(cè)指標(biāo)的潛能。