王躍華,陳 芳，鮮俊賢,宋沐航，高 首，張 旭

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都列五中學(xué)，四川 成都 610056)

0 引 言

獨(dú)蒜蘭是蘭科獨(dú)蒜蘭屬多年生半耐寒附生或地生珍稀植物[1].獨(dú)蒜蘭主要分布于我國的貴州、四川和云南等地，其假鱗莖半埋于苔蘚或枯枝落葉分解的有機(jī)質(zhì)層中[2].獨(dú)蒜蘭植物的干燥假鱗莖為中藥材山慈菇,具有清熱解毒，消腫散瘀的功效[3-4]，內(nèi)服可治肝癌、乳腺癌和子宮癌等，外用可治瘡毒、蛇蟲咬傷和皮膚燙傷及燒傷等.另外，獨(dú)蒜蘭作為蘭科植物，以其花形奇異、花色多樣而具有極高的觀賞價(jià)值[5]，已列入中國珍稀瀕危植物名錄中，是我國特有的二級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物.獨(dú)蒜蘭植物種子細(xì)小且無胚乳結(jié)構(gòu)，其種皮的透氣和透水性也不太好，導(dǎo)致獨(dú)蒜蘭種子在自然界中萌發(fā)率極低.故本研究利用生物技術(shù)，從多個(gè)方面開展了提高獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)條件的研究.

1 材料與方法

1.1 材 料

獨(dú)蒜蘭植物蒴果采于四川省都江堰市龍池鎮(zhèn)，經(jīng)四川師范大學(xué)生命科學(xué)院馬丹煒教授鑒定為蘭科獨(dú)蒜蘭屬獨(dú)蒜蘭植物.

1.2 方 法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的影響

將經(jīng)過0.05 mol/L次氯酸鈣浸種處理的獨(dú)蒜蘭種子分別接種在MS、1/2MS、1/4MS和B5基本培養(yǎng)基中，加入20 g/L蔗糖.以種子突破種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，30 d后統(tǒng)計(jì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率.

1.2.2 獨(dú)蒜蘭叢生芽增殖培養(yǎng)研究

選取帶頂芽的獨(dú)蒜蘭培養(yǎng)材料，在接入培養(yǎng)基前切除頂芽部分，采用L16(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究對(duì)獨(dú)蒜蘭植物叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響見表1，本實(shí)驗(yàn)采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B5+2 g/L活性炭+20 g/L蔗糖.

表1 水平因素表

1.2.3 獨(dú)蒜蘭無根苗生根壯苗研究

以1/2MS+ 2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+30.0 g/L蔗糖作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0.0、0.1、0.3、0.5mg/L)和IBA(0.0、0.1、0.2、0.3 mg/L)，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)獨(dú)蒜蘭無根苗的生根率和平均生根數(shù).

1.2.4 數(shù)據(jù)計(jì)算公式

種子萌發(fā)率=(突破種皮的種子數(shù)/種子總數(shù))×100%

叢生芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出叢生芽的培養(yǎng)材料/接種的培養(yǎng)材料)×100%

產(chǎn)生叢生芽的平均數(shù)= 產(chǎn)生叢生芽的總個(gè)數(shù)/誘導(dǎo)出叢生芽的培養(yǎng)材料

生根率= (生根的無根苗數(shù)/接種的無根苗數(shù))×100%

平均生根數(shù)= 生根總數(shù)/生根的無根苗數(shù)

5株獨(dú)蒜蘭組培苗平均鮮重：隨機(jī)秤取5株獨(dú)蒜蘭組培苗的重量

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的影響

本研究將處理后的種子接入不同基本培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為(20±2)℃，光照強(qiáng)度為500～800 lx，光照時(shí)間24 h/d的條件下培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，在A1～A4中，以A4即B5基本培養(yǎng)基的種子萌發(fā)率最高為92 %；A3即在1/4MS培養(yǎng)基種子萌發(fā)率最低為79.33 %.綜上所述，B5培養(yǎng)基更有利于獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)，這與張麗娜等[4]對(duì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)研究結(jié)果一致，即B5培養(yǎng)基促進(jìn)種子萌發(fā)和原球莖生長的優(yōu)勢更明顯.黃永會(huì)等[5]在對(duì)云南獨(dú)蒜蘭進(jìn)行種子萌發(fā)時(shí)，也確定B5培養(yǎng)基效果最佳.

2.2 正交試驗(yàn)研究獨(dú)蒜蘭叢生芽誘導(dǎo)增殖

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將切去頂芽的獨(dú)蒜蘭培養(yǎng)材料接入L16(43)正交試驗(yàn)的培養(yǎng)基中，在溫度為(20±2)℃，光照強(qiáng)度為2 000～2 300 lx，光照時(shí)間為24 h/d的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4.

表3 不同因素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響

表4 方差分析表

由表3可知，不同因素對(duì)獨(dú)蒜蘭叢生芽誘導(dǎo)和增殖效果都不一樣.分別從叢生芽誘導(dǎo)率和平均產(chǎn)生叢生芽數(shù)兩個(gè)指標(biāo)來看，編號(hào)12配方即A3B4C4的叢生芽誘導(dǎo)率最高為93 %，編號(hào)7配方即A2B3C3產(chǎn)生叢生芽平均數(shù)最高為7.63個(gè).通過觀察發(fā)現(xiàn)，切除帶頂芽培養(yǎng)材料在接入編號(hào)12培養(yǎng)基后15 d，在材料的切口處出現(xiàn)明顯膨大，并開始愈傷化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，在愈傷化的組織表面開始長出淺綠色的多個(gè)小芽點(diǎn)，隨后芽點(diǎn)逐漸長大，可形成帶有2～3片小葉的無根幼苗.

通過極差分析3個(gè)因素對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)率影響大小分別為A>C>B，即TDZ的影響最大的，肌醇次之，KT影響最??；進(jìn)一步根據(jù)各水平的均值大小，篩選出了叢生芽誘導(dǎo)的最佳組合為A3B2C4，即為B5+TDZ 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+200.0 mg/L肌醇+2.0 g/L活性炭+20 g/L蔗糖.通過進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得叢生芽誘導(dǎo)率在培養(yǎng)60 d后可達(dá)到98.00%，平均產(chǎn)生叢生芽數(shù)達(dá)到6.80個(gè).

通過極差分析3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)生叢生芽的平均數(shù)影響大小依次為A>B>C，即TDZ的影響最大的，KT影響次之，肌醇影響最小；進(jìn)一步根據(jù)各水平均值大小，確定了叢生芽數(shù)增殖的最佳組合為編號(hào)7配方，即A2B3C3.

根據(jù)表4方差分析結(jié)果可知，對(duì)叢生芽誘導(dǎo)率，因素A即TDZ達(dá)到了極顯著水平，因素C即肌醇達(dá)到了顯著水平，說明TDZ因素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)率影響最大，其次是肌醇，影響最小的因素是KT.根據(jù)Duncan檢驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ對(duì)叢生芽誘導(dǎo)率影響最大的是水平3，即濃度為2.0 mg/L，肌醇影響最大的水平為4，即濃度為200.0 mg/L.

對(duì)產(chǎn)生叢生芽的平均數(shù)，因素A即TDZ達(dá)到了極顯著水平，因素B即KT達(dá)到了顯著水平，根據(jù)Duncan檢驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ對(duì)增加叢生芽平均數(shù)影響最大的水平為2,即濃度為1.0 mg/L ，KT影響最大的水平為3，即濃度為1.5 mg/L.

由此可見，方差分析的結(jié)果與極差分析結(jié)果是一致的，說明TDZ、KT和肌醇對(duì)于叢生芽誘導(dǎo)和增加叢生芽數(shù)都具有重要的作用.

綜上，本研究選擇A3B2C4，即為B5+TDZ 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+200.0 mg/L肌醇+2.0 g/L活性炭+20.0 g/L蔗糖作為獨(dú)蒜蘭叢生芽誘導(dǎo)增殖最佳配方.

2.3 獨(dú)蒜蘭無根苗生根壯苗研究

切取叢生芽上生長長度為2.0～3.0 cm的無根苗(見圖1)，接入1/2MS+ 2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+30.0 g/L蔗糖作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的配方中，在溫度為(20±2)℃，光照強(qiáng)度為1 800～2 100 lx，光照時(shí)間12 h/d的條件下，培養(yǎng)60 d，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5.

圖1 獨(dú)蒜蘭叢生芽

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)無根苗生根壯苗的影響

續(xù) 表

由表5可知，在B1組不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，其無根苗的生根率和平均生根數(shù)都是較低的，即生根率為64.67%、平均生根數(shù)1.83條，并且測得獨(dú)蒜蘭組培苗的重量也是最輕的，即5株獨(dú)蒜蘭組培苗的平均鮮重僅為7.60 g；在B2～B4組中，即6-BA濃度保持在0.1 mg/L，IBA濃度由0.1 mg/L上升到0.3 mg/L時(shí)，其生根率、平均生根數(shù)和平均鮮重都呈現(xiàn)出先升高后降低的變化，其中以B3組，即當(dāng)在6-BA濃度為0.1 mg/L、IBA濃度為0.2 mg/L時(shí)，其生根率、平均生根數(shù)和平均鮮重都是最高，即生根率為100 %，平均生根數(shù)為3.20條、5株獨(dú)蒜蘭組培苗的平均鮮重為21.11 g；在B10組中，當(dāng)培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度都升到最高，即6-BA濃度為0.5 mg/L，IBA濃度為0.3 mg/L時(shí)，生根率和平均生根數(shù)卻都是最低，即生根率僅為61.67%,平均生根數(shù)僅為1.73條.

綜上所述，獨(dú)蒜蘭的最佳生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+20.0 g/L蔗糖，培養(yǎng)60 d后，其獨(dú)蒜蘭植株的生根率為100.00%，平均生根數(shù)為3.20條，平均鮮重為21.11 g，見圖2.

圖2 獨(dú)蒜蘭組培苗

3 討 論

蘭科植物在利用生物技術(shù)快速繁殖培養(yǎng)過程中，大多數(shù)會(huì)采用根狀莖增殖，極少會(huì)形成類似愈傷組織的結(jié)構(gòu)[6].陳進(jìn)勇等[7]用惠蘭和墨蘭種子進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在植物生長調(diào)節(jié)劑的作用下通過誘導(dǎo)愈傷組織形成，進(jìn)一步分化出芽.TDZ是苯基脲型的細(xì)胞分裂素，可以去除頂端優(yōu)勢，誘導(dǎo)形成叢生芽或者側(cè)芽[8].張?jiān)虑俚萚9]發(fā)現(xiàn)4.0 mg/L TDZ處理可以使小麥幼胚莖尖誘導(dǎo)形成叢生芽.本研究采用了較高濃度的TDZ培養(yǎng)去掉了頂芽的獨(dú)蒜蘭培養(yǎng)材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)材料在愈傷化的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生出叢生芽，這與文獻(xiàn)[10]的研究結(jié)果一致.

在誘導(dǎo)培養(yǎng)叢生芽過程中，添加一定濃度的肌醇物質(zhì)，對(duì)獨(dú)蒜蘭植物組織細(xì)胞快速生長有促進(jìn)作用.劉寶光等[11]在紅皮云杉的胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)中，通過添加適當(dāng)濃度的肌醇，可誘發(fā)紅皮云杉早期原胚的形成.另外，肌醇還是植物抗逆環(huán)境生長的關(guān)鍵因子，在某些植物細(xì)胞程序死亡的過程中，有發(fā)揮信號(hào)分子的作用[12].

生根壯苗是完成獨(dú)蒜蘭優(yōu)質(zhì)種苗培育至關(guān)重要的一步.本研究通過對(duì)基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑的研究，獲得了獨(dú)蒜蘭生根壯苗的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.2 mg/L +6-BA 0.1 mg/L+2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+20.0 g/L蔗糖.此研究成果可為工廠化生產(chǎn)獨(dú)蒜蘭優(yōu)質(zhì)種苗提供重要的技術(shù)支撐，在一定程度上可緩解獨(dú)蒜蘭植物資源嚴(yán)重短缺的難題.