王瑜 韓文冰 朱倩 藺立棟 王能飛 張波濤

(1 青島大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266071; 2 自然資源部第一海洋研究所,山東 青島 266061)

提要 氮是植物生長的主要營養(yǎng)限制因子,為了探索北極近岸地區(qū)植物根際土壤細(xì)菌群落多樣性受氮元素的影響作用,采用16S rDNA 擴增子測序分析了2014—2016年新奧爾松地區(qū)(Ny-?lesund,Arctic)的3 種典型植物根際土壤和本底土壤樣品。結(jié)果顯示,可溶性無機氮鹽(-N,-N,-N)與3 種植物根際土壤整體細(xì)菌群落呈顯著相關(guān)性(P ＜ 0.05)。Nitrosomonadaceae_uncultured (P ＜ 0.05,r2 = -0.77)和 Subgroup 6_norank (P ＜ 0.01,r2 = -0.87)是北極柳根際土壤的核心優(yōu)勢類群,與-N 密切相關(guān)。Subgroup 6_norank(P ＜ 0.01,r2 = -0.92)和JG34-KF-361_norank (P ＜ 0.05,r2 = 0.73)與珠芽蓼根際土壤的-N 顯著相關(guān)。抬頭地楊梅根際土壤中的Acidimicrobiales_norank (P ＜ 0.05,r2 = -0.74)和Anaerolineaceae_uncultured (P ＜ 0.01,r2 = 0.93)與-N 有明顯的相關(guān)性。研究表明,可溶性無機氮鹽對北極植物根際土壤細(xì)菌群落多樣性尤其是核心菌群的變化起到重要作用。

0 引言

當(dāng)前,全球環(huán)境面臨著一個重大挑戰(zhàn)—— 氣候變化迅速。北極氣候正在迅速變化,增加了諸如二氧化碳、甲烷和一氧化二氮等溫室氣體更快釋放的可能性[1-2]。Walker 等[3]對苔原生態(tài)系統(tǒng)進行變暖實驗發(fā)現(xiàn),氣溫升高使禾本科植物和落葉灌木數(shù)量增加,而苔蘚和地衣數(shù)量減少。氣候變化引起的生態(tài)環(huán)境變動正在逐漸影響陸地生物多樣性的分布,這是生物地球化學(xué)過程的關(guān)鍵驅(qū)動力[4]。微生物在極地陸地環(huán)境中占據(jù)主導(dǎo)地位,在驅(qū)動地球大部分氮循環(huán)的生物地球化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。在生物多樣性方面,土壤微生物多樣性是植物群落動態(tài)的重要調(diào)控因子,也是陸地生態(tài)系統(tǒng)中植物多樣性和生產(chǎn)力的重要驅(qū)動力[7],并參與了土壤中大部分養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[8]。Chong 等[9-10]研究南極不同地區(qū)土壤微生物的分布格局,指出微生物多樣性的特殊性取決于環(huán)境的具體理化參數(shù)、植被的存在和海拔因素。在很大程度上,環(huán)境變化引起的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變在土壤理化因子的動態(tài)變化中有所體現(xiàn)[11]。因此,通過分析土壤中微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu),可以進一步評估全球變暖對北極生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和穩(wěn)定性的影響機制[12]。

北極的植被類型、生物豐富度和降水量均高于南極,并且北極受全球變暖影響的程度是地球上其他地區(qū)的2～4 倍。中國黃河站周圍多苔原和濕地,生長的低等植物主要為苔蘚和地衣,高等植物比較少,如發(fā)草及少數(shù)廖科植物,是研究高緯度北極土壤微生物的理想場所[13]。植物和土壤微生物是北極陸地生態(tài)系統(tǒng)的兩個重要組成部分,它們之間的相互作用是連接地上和地下生態(tài)系統(tǒng)的重要紐帶[14-15]。北極因其寒冷干燥的惡劣環(huán)境,很少能有生長季節(jié)超過40～50 天的植物生存,當(dāng)?shù)卣贾鲗?dǎo)地位的生產(chǎn)者主要是墊形植物、蓮座叢和簇狀禾本科植物[16]。除莎草以外的禾本科植物是極地半荒漠景觀的主要植物群落,維管植物覆蓋約10%～20%,隱花植物約覆蓋40%～70%[17]。

根際被認(rèn)為是植物的第二基因組,是研究根系、土壤和微生物相互作用的一個熱點。越來越多的研究證實,根際微生物的多樣性和組成受植物物種[18-19]、土壤類型[20]和根系分泌物的影響[21],其中根系分泌物通過改變土壤的理化性質(zhì)的方式調(diào)節(jié)附近的微生物群落[22-23]。20 世紀(jì)末,研究報道土壤微生物種群可以對植物根部附近有機養(yǎng)分的釋放做出反應(yīng),北極地區(qū)的植物覆蓋區(qū)土壤具有更高的微生物多樣性[24]。Avery 等[25]的研究結(jié)果還表示環(huán)境紫外線輻射水平通過影響根分泌物的質(zhì)量或數(shù)量間接影響南極發(fā)草的根際微生物多樣性。Fierer 和Jackson[26]的研究表明,土壤pH值對微生物多樣性分布具有顯著性影響。Lemanceau 等[27]和Richardson 等[28]證實土壤中營養(yǎng)物質(zhì)(如鐵、磷酸鹽等)的缺乏也會影響微生物群落組成和結(jié)構(gòu)。Glanville 等[29]發(fā)現(xiàn)北極苔原生態(tài)系統(tǒng)溫度和含水量的變化對土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)同樣具有控制作用。Bueno de Mesquita 等[30]指出,與苔蘚覆蓋的土壤相比,非植被覆蓋的極地土壤的微生物群更少。

而根際微生物進行的生物化學(xué)過程也影響著土壤理化特性,兩者之間存在雙向反饋作用。最新研究發(fā)現(xiàn)有植被覆蓋的區(qū)域,土壤的礦化活動更為活躍[31]。Kumar 等[32]研究北極先鋒植物Oxyria digyna(L.) Hill 和Saxifraga oppositifoliaL.的根際土壤細(xì)菌多樣性和功能,表示根際菌群對氧化應(yīng)激和特定抗生素的耐受能力與根際群落種類有關(guān)。Given 等[33]通過實驗證實北極高山植物Oxyria digyna(L.) Hill 的野生根際土壤中含有豐富的磷酸鹽增溶和重氮細(xì)菌類群。Park 等[34]證實溫度升高引起的永久凍土融化和早期融雪增加了土壤含水率,并導(dǎo)致微生物活動增加,故而促進淺層土壤植物有效氮的增加,高水平的土壤氮素又會促進次年夏天灌木的生長。此外,Liu 等[35]從新奧爾松地區(qū)的Saxifraga oppositifolia根際土壤中分離到的Pontibacter arcticussp.nov.與重氮菌具有高度相似性。

鑒于目前有關(guān)北極植物根際土壤細(xì)菌多樣性具體受哪些土壤理化因子的影響以及根際細(xì)菌群落中哪些優(yōu)勢核心屬主導(dǎo)著整體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究文獻(xiàn)較少,我們重點分析了北極3 種典型植物根際土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性之間的年際變化及兩者之間的相關(guān)性。本研究于2014—2016年采集36 個北極新奧爾松地區(qū)黃河站附近的北極柳(Salix arctica)、珠芽蓼(Bistorta viviparum)、抬頭地楊梅(Luzula confuse)以及無植被覆蓋的本底土壤樣品,通過對所采集的土壤樣品進行16S rDNA 高通量測序,并結(jié)合相應(yīng)的9 種土壤理化性質(zhì)進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明: 3 種根際土壤的主要優(yōu)勢屬豐度和可溶性無機氮鹽含量具有明顯的年際變化特征,且存在顯著相關(guān)性(P＜ 0.05)。本研究的目的是將北極土壤的理化參數(shù)與根際微生物數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián),從而獲得更多北極地區(qū)根際細(xì)菌群落多樣性的年際變化信息,從而進一步探索微生物資源的應(yīng)用價值,為預(yù)測全球氣候變化和構(gòu)建北極土壤生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究地點和土壤取樣

實驗土壤樣品采集于北極新奧爾松地區(qū)(78° 40'N～79°00'N,11°20' E～12°30'E)。 該地區(qū)的植被主要以苔原和濕地為主,生長的低等植物主要是苔蘚和地衣,而高等植物較少,例如Oxyria digyna(L.) Hill,Bistorta viviparumL.,Dryas octopetalaL.,Salix arcticaPall.,Luzula confusaLindeb.,Saxifraga nivalisL.等。本研究所選的的3種植物(北極柳、珠芽蓼、抬頭地楊梅)是北極新奧爾松地區(qū)黃河站附近的常見植物物種。

北極柳(Salix arctica)是一種分布在北極的匍匐落葉灌木,被稱為后來的冰川地區(qū)定居者,是斯瓦爾巴群島(Svalbard)裸露山脊的優(yōu)勢物種,能形成外生菌根。它的高度通常低于10 cm,呈墊形。最新研究指出由于其較高的葉片光合作用能力,北極柳在碳固存中發(fā)揮著關(guān)鍵效力[36]。珠芽蓼(Bistorta vivipara)是一種環(huán)極地的多年生草本植物,生長在北極和高山苔原上[37],是少數(shù)能形成外生菌根的草本植物之一,幾乎完全通過珠芽無性繁殖[38]。抬頭地楊梅(Luzula confuse)是北極高地維管植物類群中最常見的種類之一,常生長于潮濕的生境中,是廣泛分布在黏性土壤到沙質(zhì)土壤中的環(huán)極物種[39],其低根冠比、低葉溫、高水勢和低葉阻的特性是對北極低溫和強輻射做出的適應(yīng)性改變,主要以內(nèi)生菌根為主[40]。

連續(xù)3年選取北極地區(qū)3 種優(yōu)勢植物(Salix arctica、Bistorta vivipara、Luzula confusa)根際土壤樣品作為研究對象,編號分別為Sar、Bvi 和Lco。選擇無植被覆蓋土壤作為對照組,編號BG。這些樣本來自中國第6 次、第7 次和第8 次北極科學(xué)考察。采集樣品的方法[41]是在距植物根附近土壤的表面土壤2～5 cm 范圍內(nèi),用無菌鏟刮取約50 g 土壤樣品,直接放入無菌塑料取樣袋,一式三份,平行樣本之間間隔1 m 并呈三角形分布(圖1a)。樣品在中國的北極考察站黃河站-20℃的冰箱中暫存,然后乘飛機送到國內(nèi)實驗室。在飛行過程中,樣本保存在裝有冷凍冰袋的恒溫箱中。在國內(nèi)實驗室,土壤樣品在-80 ℃冷凍,直到核酸提取[42]。共36 個土壤樣品。

圖1 a)新奧爾松地區(qū)土壤樣品采集; b)采樣站位全景圖Fig.1.a) Soil sample collection in Ny-?lesund (Arctic); b) panorama of sample collection stations

1.2 土壤樣品理化性質(zhì)

實驗測量了總共9 種土壤理化性質(zhì),即pH值、含水率(MC)、有機碳(TOC,Total Organic Carbon)、有機氮(TON,Total Organic Nitrogen)、-N、-Si、-N、-P 和-N(圖2)。MC 的測定為濕土(每個樣品10 g)在105 ℃條件下烘干至恒重[43]后的重量失重。稱取2 g 土壤加入5 mL 去離子水(現(xiàn)用現(xiàn)制并超聲處理),渦旋振蕩1 min,靜止30 min 后用pH 計(PHS-3C,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司,上海,中國)測量pH。為測量其他7 項理化性質(zhì),每個樣本稱取8 g 土壤置于60 mm 培養(yǎng)皿中并編號,放入凍干機中凍干48 h,并用瑪瑙研缽研磨成粉末。有機碳和有機氮按照以下程序進行測定。稱取 0.1～ 0.2 g 土壤樣品,用10%的鹽酸處理,隨后用去離子水多次沖洗以完全去除鹽酸,置于50 ℃干燥后用元素分析儀(EA3000,Euro Vector SpA,Milan,Italy)[44]測定,含量以百分比表示。取2 g 土壤到50 mL 離心管中,按1∶10(g·mL-1)的比例加20 mL去離子水。每4 h 震蕩一次,處理48 h 后,用營養(yǎng)自動分析儀(QuAAtro,SEAL,Germany)按相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜ 5%[45]測定其他五項營養(yǎng)鹽(-N,-Si,-N,-P,-N)含量[46-47]。

1.3 DNA 提取和PCR 擴增

從36 個土壤樣本(3年 × 4 種土壤類型 × 3 個平行樣本:Salix arctica+Luzula confusa+Bistorta vivipara+ 空白)中提取基因組DNA[48]。使用MO BIO Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories,San Diego,CA,USA),按照廠家說明從0.25 g 土壤樣品中提取,用瓊脂糖凝膠檢測DNA提取物的純度和濃度,選擇合格的樣品[42]進行后續(xù)實驗。使用引物 806R(5′-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3′)和 341F(5′-CCTAYGGGRBGCAS CAG-3′)擴增16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)。所有PCR 反應(yīng)在25 μL 的體系內(nèi)進行,包括15 μL Phusion R 高保真PCR Master Mix(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA),0.2 mmol·L-1正向和反向引物,10 ng 模板DNA。PCR 產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液(1×,含SYBR green)混合,裝入2%瓊脂糖凝膠中檢測。選擇分子量在400～450 bp 之間的樣品,使用Gene JET 凝膠萃取試劑盒(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)進行純化[47,49]。擴增子文庫用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample preparation Kit(Illumina,USA) 制備 ,用QuantiFluor?- ST (Promega,USA)進行定量[50]。

1.4 測序和數(shù)據(jù)分析

純化后的擴增產(chǎn)物在北京諾禾致源有限公司的Illumina MiSeq 平臺上進行測序。使用微生物生態(tài)學(xué)定量分析(QIIME,version 1.7.0)工作流程對序列進行質(zhì)量過濾、嵌合體檢查、劃分可操作分類單元(OTUs)[51]。原始的16S rRNA 基因序列讀數(shù)用QIIME 軟件過濾以去除引物和barcodes,然后用FLASH 軟件合并[48,52],利用Uparse 軟件對所有的有效序列按相似度97%(Identity)進行聚類成OTUs,并對每個OTUs 的代表序列進行物種注釋,物種數(shù)據(jù)庫選擇SSU rRNA,得到細(xì)菌的物種分類學(xué)信息。對數(shù)據(jù)均一化處理后,使用R 語言和QIIME 計算土壤微生物的α 和β-多樣性[53]。通過α-物種多樣性和β-物種多樣性結(jié)果評估微生物多樣性的豐富度和均勻度。α-多樣性分析包括Chao1、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)和Good’s coverage。β-多樣性分析能反映出樣本之間的多樣性距離關(guān)系,而且還可以反映生物群落之間的分化程度,從而用于確定土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落多樣性之間的相關(guān)性[48]。采用線性判別效應(yīng)量(LEfSe)方法對不同采樣位點間差異顯著的細(xì)菌類群進行鑒別(LDA score ＞ 4)。 在相關(guān)性分析之前,先對3年土壤理化性質(zhì)進行常規(guī)統(tǒng)計——變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV),消除測量尺度和量綱的影響,以表示每個樣本理化性質(zhì)的總體變異性和兩組差異明顯的數(shù)據(jù)的離散程度[54]。

標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比值稱為變異系數(shù),由下式計算得到:

根據(jù)去趨勢對應(yīng)分析(DCA)結(jié)果,第一軸長度小于3.0,我們選擇冗余分析(RDA)揭示土壤理化性質(zhì)與微生物類群之間的關(guān)系,然后通過蒙特卡洛置換試驗對其進行檢驗。為確定三種根際土壤微生物群落的核心微生物群,采用R 統(tǒng)計包 v3.0.1 的“加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析”(WGCNA)進行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和對比分析[55],然后使用Cytoscape_v3.7.2 構(gòu)建4 種土壤樣品的OTUs 網(wǎng)絡(luò)圖。對4 種根際土壤的核心優(yōu)勢屬和9 個理化因子進行Pearson 相關(guān)分析(P＜ 0.05)。原始讀取數(shù)據(jù)存入NCBI 序列讀取存檔(SRA)數(shù)據(jù)庫(登錄號: SRP270629)。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

2014—2016年BG 平均pH 值為弱堿性,時間變異性低(CVpH= 8.30%)。與同年非根際土壤相比,3 種根際土壤9 個環(huán)境因子的變異系數(shù)在2014年為2.25%～134.99%,2015年為4.15%～ 119.64%,2016年為1.83%～141.42%。Nielsen 和Bouma[56]對變異系數(shù)提出了以下3 種不同類型的土壤特性變異: 0～15%變異不大; 10%～100%為中度變異性; 100%表示高變異性。表1 中的土壤理化性質(zhì)變異數(shù)據(jù)顯示,除土壤pH 值外,其他因子CV多數(shù)超過20%。特別是-N、-N、-N 和-P這4 個因子的變異系數(shù)甚至超過100%,表現(xiàn)出高度變異。

表1 36 個土壤樣品9 種土壤理化性質(zhì)的變異系數(shù)Table 1.Coefficients of variation of nine geochemical properties of 36 soil samples

2.2 細(xì)菌多樣性分析和群落組成

從36 個土壤樣品中總共獲得2025313 條原始序列,經(jīng)軟件質(zhì)量過濾后得到1520090 條序列。36 個土壤樣本的有效序列按97%的序列相似水平共聚類得到5569 個OTUs,每個樣本中OTUs平均超過1347 個,其中Lco14_2(站點Lco14 的第2 個樣本)包含的OTUs 最多(2690),Sar14_3 包含的OTUs 最少(1244)。樣品中OTUs 的覆蓋估計值在97%～99%之間,說明測序結(jié)果能更全面地反映調(diào)查區(qū)域環(huán)境微生物群落的真實情況。Chao1指數(shù)的變化范圍為1535.56～3126.72,其中指數(shù)最大的3 個站分別為Lco14、Sar16 和Lco16,物種數(shù)量最多(表2)。香農(nóng)(Shannon)指數(shù)在Lco14、Sar16 和Sar15 中較高,說明微生物多樣性較高,種群豐富,分布均勻。Lco15、BG16、Sar14 值較小,群落結(jié)構(gòu)相對簡單。根據(jù)物種累積箱線圖(species accumulation boxplot,圖3a)顯示,隨著樣本個數(shù)增加,曲線上升趨勢趨于平緩,并結(jié)合稀釋曲線(圖 3b)觀察得到樣品量足夠且測序數(shù)據(jù)量合理,結(jié)果具有代表性,由此反映出 36個土壤樣本中物種十分豐富,物種分布均勻,且逐漸趨于5600 多個物種。

在分類學(xué)上,我們可以清楚地看到,4 種土壤樣本在門水平上有不同的聚類時間模式。首先,每年的3 個Lco 樣本不僅形成了獨特的集群,也彼此分開(圖4)。第二,盡管相對不那么明顯,另一根際和BG 樣本彼此在同一個年密切相關(guān),圖4中清晰地顯示出聚集在一起的傾向。第三,2014年的三個Lco 樣品與2016年的兩個根際樣品聚在一起,相關(guān)性較強。

在門水平上,無論是根際土壤還是非根際土壤,均以變形菌門(Proteobacteria,27.16%～67.13%,平均46.15%)、放線菌門(Actinobacteria,7.30%～19.74%,平均12.78%)、酸桿菌門(Acidobacteria,4.33%～ 18.11%,平均11.53%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,3.39%～21.71%,平均 9.24%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,1.68%～17.64%,平均8.50%)占優(yōu)勢(圖4)。

圖2 2014—2016年土壤理化因子濃度直方圖Fig.2.Histogram of concentration of soil geochemical factors from 2014 to 2016

表2 36 個土壤樣品的多樣性測序數(shù)據(jù)匯總Table 2.Summary data for diversity sequencing data from 36 samples

圖3 a)物種累積箱線圖; b)基于16S rRNA 基因V3-V4 的稀釋曲線Fig.3.a) Species accumulation curves; b) rarefaction curves based on V3-V4 of 16S rDNA gene

在屬水平上,我們發(fā)現(xiàn)在所有土壤樣品中,Gemmatimonadaceae_uncultured (Gemmatimonadetes,Gemmatimonadetes,Gemmatimonadales,2.86%～ 15.23%),Sphingomonas(0.67%～19.42%),Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales,1.19%～7.16%)和Subgroup 6_norank (Acidobacteria,0.77%～8.22%)為優(yōu)勢類群(排名前 4),亞優(yōu)勢類群為 MNG7_ norank(Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales,0.56%～3.99%),JG34-KF-161_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Sphingomonadales,0.06%～6.16%),JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales,0.11%～4.91%)和RB41(0.07%～7.45%)。

除此之外,我們還比較了土壤理化因子對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。根據(jù)LEfSe 結(jié)果,36個樣本中有50 個類群的LDA score(線性判別分析)大于 4(顯著性檢驗的截止值)(圖 5)。 Sar16 和 Sar14 的分類群最多,分別為 20%和18%。這兩個地點的分類單元較其他地點更為豐富,包括變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和酸桿菌門。

圖4 36 個土壤樣品中細(xì)菌群落組成在門水平的相對豐度Fig.4.Relative abundance of bacterial community compositions at Phylum levels in 36 soil samples

圖5 2014—2016年四種土壤樣品的LEfSe 分析(默認(rèn)預(yù)設(shè)值為4.0,P ＜ 0.05 視為顯著).a)北極柳根際土壤; b)珠芽蓼根際土壤; c)抬頭地楊梅根際土壤; d)本底土壤Fig.5.LEfSe analyses of four soil samples from 2014 to 2016 (default preset value = 4.0,P-values ＜ 0.05 considered significant).a) Salix arctica rhizosphere soil; b) Bistorta vivipara rhizosphere soil; c) Luzula confusa rhizosphere soil; d) background soil

2.3 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的相關(guān)性分析

為了探究理化因素在根際土壤整體細(xì)菌群落多樣性中是否隨時間的變化而發(fā)揮不同的作用,我們進行了RDA 分析(圖6)和蒙特卡洛置換檢驗(表3)。

表3 4 種土壤的環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成關(guān)系的蒙特卡洛置換檢驗Table 3.A Monte Carlo permutation test of relationship between environmental factors and bacterial community composition of four soils

如圖6 所示,每個根際土壤樣品的3 個平行樣品相互簇聚,不同根際樣品相互分離,時間變化明顯。首先,我們發(fā)現(xiàn)在4 種土壤樣品中,除Sar 樣品外,相比其他參數(shù),-Si(r2= 0.95,P＜ 0.01)與細(xì)菌群落總體組成相關(guān)性強。同時,2016年除Lco 外,-Si 對其他3 種土壤樣品的影響更大。其次,Sar 樣品的-N(r2= 0.86,P＜ 0.01)較其他3 種土壤樣品與細(xì)菌群落總體組成存在顯著相關(guān)性。第三,2015年Bvi 樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受-N 影響最大(r2= 0.95,P＜ 0.01)。RDA 結(jié)果顯示,3年的Lco 樣品與-N 也有一定的相關(guān)性。從BG 的RDA 圖可以看出,在無植物土壤中,-N、-N、-N 與細(xì)菌群落組成的相關(guān)性低于其他6 個土壤理化因子。顯然,-N、-N 和-N 對影響根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和組成起主要作用。此外,36 個土壤樣本的RDA 結(jié)果(圖7)表明,3 種根際土壤整體細(xì)菌群落與本底土壤發(fā)生明顯分離。9 項理化性質(zhì)的蒙特卡洛置換檢驗(表4)表明,-N(r2= 0.3378,P＜ 0.01)、TOC(r2= 0.3414,P＜ 0.01)、含水率(r2= 0.2883,P＜ 0.01)、pH(r2= 0.2157,P＜ 0.05)、TON(r2= 0.2118,P＜ 0.05)對36 個樣本的整體細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著影響,而-N(r2= 0.1428,P= 0.079)相關(guān)性較低,-N 和-P 與細(xì)菌群落沒有顯著相關(guān)性。

圖6 基于距離的冗余分析.a)北極柳根際土壤; b)珠芽蓼根際土壤; c)抬頭地楊梅根際土壤; d)本底土壤Fig.6.Distance-based redundancy analysis.a) Salix arcticarhizosphere soil; b) Bistorta vivipara rhizosphere soil; c) Luzula confuse rhizosphere soil; d) background soil

圖7 基于距離的冗余分析顯示2014—2016年36 個土壤樣品中細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性.箭頭代表測量的土壤理化因子Fig.7.Distance-based redundancy analysis revealed correlations between bacterial communities and environmental factors in 36 samples from 2014 to 2016.The arrows represent geochemical factors measured

表4 36 個樣本的環(huán)境因子與整體細(xì)菌群落組成關(guān)系的蒙特卡洛置換檢驗Table 4.A Monte Carlo permutation test of relationship between environmental factors and overall bacterial community composition in 36 samples

我們利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)的結(jié)果(前200 個權(quán)重值)來確定這些復(fù)雜OTUs網(wǎng)絡(luò)中最有效的OTU,并找到每個根際的核心類群(圖8)。不同植被的根際土壤具有相同的核心類群和其特有的核心類群,但它們的相對豐度各不相同。我們發(fā)現(xiàn)四個站點土壤中的共同核心類群為Subgroup 6_norank (Acidobacteria)。Sar 和Bvi共有的核心類群為Gemmatimonadaceae_uncultured

(Gemmatimonadetes,Gemmatimonadetes,Gemmatimonadales),Bacillus。Sar 和Lco 共有的核心類群為Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)。此外,這4 種土壤的OTUs 網(wǎng)絡(luò)都有其特有的核心類群: Sar 站位有 Cytophagaceae_uncultured (Bacteroidetes,Cytophagia,Cytophagales); Bvi 有Oryzihumus,H16,JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales) 和Sphingomonas;Lco有S0134 terrestrial group_norank (Gemmatimonadetes),RB41,Anaerolineaceae_uncultured(Chloroflexi,Anaerolineae,Anaerolineales),Pedobacter,Massilia,Acidimicrobiales_norank (Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales)和Xanthomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Gammaproteobacteria,Xanthomonadales)。DA101 soil group_norank (Verrucomicrobia,Spartobacteria,Chthoniobacterales),Methylotenera和Gemmatimonas是BG 特有的核心類群。

為進一步探討根際土壤核心優(yōu)勢類群和土壤理化因子的年際變化,確定它們之間的聯(lián)系。我們將LEfSe 分析得到的差異顯著的類群(圖5)和網(wǎng)絡(luò)分析得到的核心類群與9 項理化因子共同進行Pearson 相關(guān)分析(Pearson 相關(guān)系數(shù)見表5)。結(jié)合各位點優(yōu)勢類群,我們發(fā)現(xiàn)在Sar 中,處于核心位置、豐度較高且差異顯著的類群包括Subgroup 6_norank (Acidobacteria),Cytophagaceae_uncultured (Bacteroidetes,Cytophagia,Cytophagales),Nitrosomonadaceae_uncultured(Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)和Bacillus。Bvi 中存在 Subgroup 6_norank (Acidobacteria),JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales),Oryzihumus,H16 和Sphingomonas。以及,Lco 中 Acidimicrobiales_ norank (Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales),RB41,Anaerolineaceae_uncultured (Chloroflexi,Anaerolineae,Anaerolineales)。而BG的優(yōu)勢核心類群為 DA101 soil group_norank (Verrucomicrobia,Spartobacteria,Chthoniobacterales)和Methylotenera。顯然,植物類型的差異導(dǎo)致了土壤核心優(yōu)勢菌群的變化。這與蒙特卡洛置換檢驗的結(jié)果一致。Pearson 分析結(jié)果表明,優(yōu)勢核心類群與土壤中可溶性無機氮鹽具有較強的功能對應(yīng)性。

3 討論

圖8 36 個土壤樣品中細(xì)菌群落加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖.a)北極柳根際土壤; b)珠芽蓼根際土壤; c)抬頭地楊梅根際土壤; d)本底土壤.顏色越深,尺寸越大,相關(guān)性越強; 相反的比較弱Fig.8.Network diagram of weighted gene co-expression of bacterial communities in 36 soil samples.a) Salix arctica rhizosphere soil; b) Bistorta vivipara rhizosphere soil; c) Luzula confuse rhizosphere soil; d) background soil.The darker the color,the larger the size,the stronger the correlation.The opposite is weaker

表5 土壤理化性質(zhì)與根際土壤/本底土優(yōu)勢細(xì)菌類群豐度的相關(guān)系數(shù)Table 5.Pearson correlation coefficients of relative abundance of the dominant bacterial groups in rhizosphere soils and bulk soils with soil properties

續(xù)表5

在分類學(xué)上,我們發(fā)現(xiàn)4 個根際土壤的細(xì)菌群落具有不同的時間聚類模式。在分類學(xué)水平上的統(tǒng)計分析表明,3 種根際土壤的優(yōu)勢菌群組成相似,但在不同根際土壤樣品中發(fā)現(xiàn)了不同的差異。如細(xì)菌群落多樣性的變化和特定功能微生物組的存在。根際土壤核心優(yōu)勢類群豐度變化與土壤理化因子之間是否存在交互作用呢？

據(jù)基于距離的冗余分析和蒙特卡洛置換檢驗結(jié)果可知,除了pH 值和MC 外,新奧爾松地區(qū)植物根際土壤的7 種土壤理化性質(zhì)與根際細(xì)菌群落多樣性和組成顯著相關(guān)。其中,3 種可溶性無機氮鹽與細(xì)菌群落多樣性的相關(guān)性最高。在Sar 位點,-N (r2= 0.86,P＜ 0.01)相關(guān)性最高。在Bvi 位點,-N (r2= 0.93,P＜ 0.01)的相關(guān)性最大,而在Lco 位點,-N (r2= 0.86,P＜ 0.01)的相關(guān)性最大。本底土壤中,-Si (r2= 0.80,P＜ 0.01)的相關(guān)性最強,其他理化因素次之。與其他可溶性營養(yǎng)鹽相比,根際土壤中可溶性無機氮鹽與細(xì)菌群落整體多樣性和組成顯著相關(guān)。Van Der Heijden 等[57]研究發(fā)現(xiàn),根分泌物間接介導(dǎo)了有益微生物和病原微生物的相互作用,對根際土壤細(xì)菌的多樣性和組成起著關(guān)鍵作用。對比 3年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),3 種根際土壤的-N、-N和-N 理化性質(zhì)的變異系數(shù)呈年變化趨勢。分析了兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)3 種根際土壤中核心優(yōu)勢類群的豐度與3 種可溶性無機氮鹽的變化是一致的。

由于近年來北極環(huán)境的變化,土壤中的氮循環(huán)發(fā)生了顯著的變化。受相關(guān)功能菌豐度變化的影響,土壤的硝化、反硝化和厭氧氨氧化過程均受到不同程度的促進和抑制。WGCNA 結(jié)果顯示,Nitrosomonadaceae_uncultured(Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)既是北極柳根際土壤的優(yōu)勢菌類群,也是其核心菌群。通過相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)該屬與-N 呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P＜ 0.01)。此外,核心優(yōu)勢類群Subgroup 6_norank(Acidobacteria)的相對豐度的年際變化和Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)是一樣的。同時發(fā)現(xiàn),該類群與根際土壤中-N 和-N 的相關(guān)性高于本底土壤。Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)和Subgroup 6_norank (Acidobacteria)的年際變化趨勢相同,而Bacillus的年際變化趨勢與前兩者相反。2014—2015年,-N 和-N 濃度呈協(xié)同作用,兩者對亞硝酸鹽呈現(xiàn)拮抗作用?；诖?我們認(rèn)為-N 和-N 的濃度影響了Subgroup 6_norank (Acidobacteria)和Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)的相對豐度,-N 濃度顯著影響芽孢桿菌的相對分布。前人研究發(fā)現(xiàn),Nitrosomonadaceae_uncultured(Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)是一種促進土壤硝化作用、爭奪土壤-N 的土壤硝化劑[56,58]。Subgroup 6_norank 屬于酸性細(xì)菌(Acidobacteria),并對土壤氮循環(huán)中的-N 和-N 濃度有降低作用[59]。Beneduzi 等[60]在巴西水稻根際土壤中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有固氮和促進植物生長活性的作用。最近研究指出,在北極新奧爾松地區(qū)先鋒植物Oxyria digyna和Saxifraga oppositifolia的根際土壤中發(fā)現(xiàn)潛在固氮細(xì)菌β-變形桿菌和藍(lán)細(xì)菌主導(dǎo)土壤細(xì)菌群落的多樣性和組成[61]。因此,在北極柳根際土壤中,3 種營養(yǎng)鹽與3 種優(yōu)勢核心類群之間相互制約、相互影響,共同促進土壤的硝化作用和固氮作用的發(fā)生,從而促進了落葉灌木的生長。

珠芽蓼和北極柳均為維管植物,但兩個根際的優(yōu)勢核心類群不同。Subgroup 6_norank(Acidobacteria)在珠芽蓼根際土壤中仍占主導(dǎo)地位。有趣的是,優(yōu)勢核心屬JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales)在珠芽蓼根際土壤中的相對豐度年際變化大于Subgroup 6_norank (Acidobacteria),且與-N 濃度高度相關(guān)(P＜ 0.05)。JG34-KF-361_norank(Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales)屬于α-變形桿菌綱的根瘤菌目。Delgado 等[62]發(fā)現(xiàn),在硝酸鹽的參與下,苜蓿根瘤發(fā)生了根瘤菌的反硝化作用。由此我們可以推斷,在珠芽蓼根際土壤中,珠芽蓼根與 JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales)之間也發(fā)生了類似的反硝化過程,后者消耗土壤中的硝酸鹽。

Acidimicrobiales_norank (Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales)是Lco 的核心類群,與-N 呈強而顯著的相關(guān)性(r= -0.74,P＜ 0.01)。Acidimicrobiaceae sp.strain A6 (A6)來自放線桿菌門,最近被鑒定為一種可進行厭氧氨氧化偶聯(lián)鐵還原(Feammox)的微生物[63]。因此,我們推測,同樣的生化過程發(fā)生在 Acidimicrobiales_norank(Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales)。 Anaerolineaceae_uncultured (Chloroflexi,Anaerolineae,Anaerolineales)與-N 也有很強的顯著相關(guān)性(r= 0.93,P＜ 0.01)。Anaerolineaceae_uncultured屬綠彎菌門中的厭氧繩菌目,但其在土壤中的厭氧硝化過程目前尚不清楚。然而,我們的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)該類群與-N 濃度有非常顯著的相關(guān)性,因此我們推斷該類群在抬頭地楊梅根際土壤中進行了反硝化作用,但具體的作用機制有待于進一步的研究驗證。同時,Lco 位點中唯一的門——浮霉菌門(厭氧氨氧化)和藍(lán)藻細(xì)菌(固氮),在北極植物根際土壤的氮循環(huán)中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[64]。Humbert 等[64]發(fā)現(xiàn)浮霉菌門參與氨的厭氧氧化產(chǎn)生N2并釋放到大氣中。相關(guān)研究結(jié)果表明,與Livingston 島采集的樣品相比,北極地殼樣品中藍(lán)藻細(xì)菌豐富度更高[65]。一些藍(lán)細(xì)菌形成異質(zhì)囊并具有固定大氣氮的能力[66]。然后,藍(lán)藻細(xì)菌通過提供固定氮(通過固定氮菌株)在生物降解中發(fā)揮著同樣重要的間接作用。

本研究發(fā)現(xiàn)的核心菌類群主要參與土壤氮循環(huán)的主要生化過程,與3 種無機氮鹽(-N,-N,-N)的變化顯著相關(guān)。植物根系對微生物驅(qū)動的土壤養(yǎng)分循環(huán)有很強的影響[57]。硝化和反硝化是微生物參與大氣氮循環(huán)的主要途徑之一,也是陸地生態(tài)系統(tǒng)氮流失的主要原因[57,67]。由于核心優(yōu)勢菌在土壤細(xì)菌群落中占有主要地位,其變化對整個細(xì)菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)變化起著主導(dǎo)作用。綜上所述,我們認(rèn)為,北極根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和組成與3 種土壤可溶性營養(yǎng)鹽的濃度變化(如-N,-N,-N)不可分割,且兩者的相互作用為北極生態(tài)系統(tǒng)抵御氣候變化提供了主要保障。