馮 潛，劉緒興，文 章，陳 杰*

（1.宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司，四川 宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北 黃石 435000）

四川盆地擁有適宜釀造的地域性環(huán)境，盛產(chǎn)各型宜人風格的濃香型白酒[1]。白酒的主要成分為乙醇和水，含量占據(jù)整個酒體的98%，余下1%～2%的微量成分，包含呈香呈味的酸類、酯類、醇醛等小分子物質(zhì)，是決定白酒獨特風格與品質(zhì)的骨架成分[2]。濃香型白酒以窖池為其獨特的發(fā)酵容器，窖池的每輪次發(fā)酵周期在90 d左右。長發(fā)酵期使窖池形成密閉的厭氧環(huán)境，其中棲息的微生物尤其是細菌類微生物對白酒骨架香味成分的積累、白酒的風格或質(zhì)量的形成具有明顯的決定作用[3]。俗話說“好窖出好酒”，優(yōu)質(zhì)窖泥中的微生物，經(jīng)歷了釀造工藝的長期篩選與馴化，形成了有益于釀造的獨特群落體系，從而塑造了濃香型白酒以芳香濃郁、綿柔甘洌為主的典型風格。窖池微生態(tài)中微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度的差異，是不同窖池所釀白酒具有質(zhì)量差異的主要因素[4]。以現(xiàn)代化微生物可培養(yǎng)或非培養(yǎng)[5]的各類技術(shù)實現(xiàn)窖泥釀造微生態(tài)體系的定向改良，使?jié)庀阈桶拙瓢l(fā)酵質(zhì)量可控，是傳統(tǒng)白酒產(chǎn)業(yè)走向現(xiàn)代化、機械化、自動化的核心問題，前提條件是解剖并認識成熟窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)，辨識其中的釀造關(guān)鍵微生物并掌握其培養(yǎng)方式[5]。本研究基于高通量測序技術(shù)，比較了新窖泥及成熟窖泥中的細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，分析了細菌群落結(jié)構(gòu)與釀造質(zhì)量的相關(guān)性，為濃香型白酒釀造質(zhì)量的提升提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試窖泥樣品（標記為LCX）：來自于宜賓六尺巷酒業(yè)正常發(fā)酵4年且生產(chǎn)的原酒主體香不突出、諸香欠缺協(xié)調(diào)的新窖池；市內(nèi)其他三家酒廠中正常發(fā)酵15年且生產(chǎn)的原酒相對風格典型、諸味協(xié)調(diào)的成熟老窖池，所選窖池執(zhí)行同一套生產(chǎn)工藝，窖期均為90 d，取窖底泥作為樣品，并依次標記為YRF、XJF、CXF；以無菌袋裝樣，4 ℃冷凍密封轉(zhuǎn)運至實驗室后，立即開展總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取。

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；DNA Marker D2000：北京天根生化科技有限公司；帶識別條碼（barcode）的細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)擴展引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3'）：北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-32全自動樣品快速研磨儀：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；Velocity 18R冷凍高速離心機：Dynamica Scientific Ltd.；Tarzan 96梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：莫納生物科技有限公司；UV 8000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；TanonEPS300凝膠電泳儀、Tanon 2500B凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；AC2-6S1生物安全操作柜：新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥總DNA提取及聚合酶鏈式反應(yīng)擴增

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）溶解細胞膜的方法[6]提取窖泥總DNA。PCR擴增體系：TaqMix 10 μL、模版1μL、正反向引物各0.5 μL，使用雙蒸水（ddH2O）補足20 μL；PCR擴增條件：94 ℃預變性10 min；每個循環(huán)包含94 ℃變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，一共循環(huán)30次；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。使用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行檢測。選擇大小在500 bp 左右，符合16S rRNA V3-V4區(qū)擴增產(chǎn)物要求的清晰單一條帶，切膠回收。對符合OD260nm值/OD280nm值=1.8～2.0、OD230nm值/OD260nm值＞2.0條件的高濃度、高純度膠條，送往擎科生物科技有限公司，借助Illumina Miseq平臺及相關(guān)資源完成高通量測序，并返回原始序列（rawdata）。

1.3.2 生物信息學分析

為了確保分析數(shù)據(jù)的準確性，利用Mothur軟件[7]對原始序列進行篩選，去掉低質(zhì)量的序列，識別和消除嵌合體，分類并去除序列首尾兩端的barcode，識別并剔除單次出現(xiàn)序列（singleton），得到過濾后的高質(zhì)量拼接序列（clean tags）。利用USEARCH軟件[8]依據(jù)序列相似性＞97%的分類要求，將clean tags聚類成為可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并在聚類過程中去除一些測序錯誤的序列，提高分析的準確性。隨后選取每個OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的完整序列作為該OTU的代表性序列，用于后續(xù)物種注釋。利用QIIME2軟件[9]中的assign_taxonomy.py腳本將每個OTU的代表序列與16S rRNA基因擴增子注釋數(shù)據(jù)庫Silva比對，獲得OTUs的物種注釋信息。再使用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）Classifier軟件[10]，設(shè)置置信度為0.5以上，校對并確認物種注釋信息的分類學結(jié)果。分類學結(jié)果包括界、門、綱、目、科、屬、種7個層級。將可注釋的OTUs應(yīng)用于物種多樣性分析，以主成分分析（principal component analysis，PCA）法[11]將樣品的群落差異最大化，找出對差異的形成具有主要奉獻度且相對豐度＞0.01%的優(yōu)勢OTUs。分析過程使用R語言完成作圖[11]。根據(jù)共培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法的微生物群落結(jié)構(gòu)中同屬的物種在代謝特征上具有相似性的發(fā)現(xiàn)[4]，使用基本局部搜索工具（basic local alignment tool，BLAST）（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢索與優(yōu)勢OTUs一致性（identity）高且正式發(fā)表的參考物種（reference species），用于系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序合理性

高通量測序后，各份樣品獲得的高質(zhì)量clean tags，經(jīng)聚類及與Silva數(shù)據(jù)庫比對后，獲取到能夠注釋的OTUs總數(shù)見表1。以稀釋性曲線評估不同樣本的測序合理程度，結(jié)果如圖1所示。由表1、圖1可知，當clean tags總數(shù)在10 000以上時，所有樣本的曲線末端趨向平坦，表明各樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠且合理，測序深度足以覆蓋樣品中存在的大多數(shù)微生物。同時，稀釋性曲線表明，樣品按物種豐富度從大到小排序依次是XJF、YRF、CXF、LCX。

表1 窖泥微生物群落多樣性比較Table 1 Comparison of the diversity of microbial community in pit mud

圖1 窯泥樣品稀釋性曲線Fig.1 Dilution curves of pit mud samples

以等級豐度曲線評估樣品的多樣性，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，樣品XJF的曲線在橫軸上的跨度最長最平坦，表明樣品XJF的物種含量相對最豐富，物種組成相對最均勻。以alpha多樣性指數(shù)評估OTUs的多樣性（表1），樣品XJF與YRF的Chao1指數(shù)最大，反映了這兩份樣品擁有比其他樣品更豐富的物種，Chao1指數(shù)結(jié)論與稀釋性曲線結(jié)論一致；樣品XJF的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均最大，反映了該份樣品中物種的復雜度、物種的均勻性與豐度相對其他樣品高，Simpson指數(shù)的結(jié)論與等極豐度曲線結(jié)論一致。而4份樣品的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)均十分理想，表明高通量測序結(jié)果良好，可用于后續(xù)物種多樣性分析。

圖2 窯泥樣品的等級豐度曲線Fig.2 Grade abundance curves of pit mud samples

2.2 優(yōu)勢微生物

以交集方式對4份樣品的OTUs開展相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 窖泥樣品的分類操作單元交集Fig.3 Count of intersection of operational taxonomic units from pit mud samples

由圖3可知，4份樣品的共有OTUs數(shù)目為291個，相對豐度達到98.764 3%。任意3份樣品的OTUs相對豐度的總和為0.731 4%。各份樣品獨有OTUs數(shù)量少，總豐度只有0.139 1%。經(jīng)過RDP classifier檢校OTUs的分類地位，發(fā)現(xiàn)4份樣品中的共有OTUs主要來自于放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacter-oidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、柔壁菌門（Tenericutes），表明同地域的不同濃香型白酒釀造廠的窖泥細菌群落類型具有高度的相似性。

基于屬水平的群落結(jié)構(gòu)豐度圖（圖4）直觀地橫向比對出各份樣品細菌群落在屬上具有明顯差異，同時也發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes、Spirochaetae、Firmicutes門類微生物在各樣品中的相對豐度占絕對優(yōu)勢。

圖4 窖泥細菌群落在屬水平的結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Structure distribution of bacterial communities in pit mud at genus level

對樣品進行PCA，發(fā)現(xiàn)30個OTUs對窖泥樣品間細菌群落結(jié)構(gòu)的差異形成具有重要影響（圖5），且全部來源于樣品共有的OTUs中，屬于優(yōu)勢OTUs。

圖5 對樣品差異具有重要影響的操作分類單元矩陣的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of matrix of operational taxonomic units with important effects on sample difference

2.3 窖泥細菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析

經(jīng)過BLAST檢索，優(yōu)勢OTUs及其參考物種形成見表2。參考物種主要來源于各種各樣的厭氧環(huán)境[3，12-36]，在系統(tǒng)分類上全部歸屬于Bacteroidetes，Spirochaetae，F(xiàn)irmicutes，對優(yōu)勢OTUs具有較高的序列相似性（91%～100%）。將參考物種的屬作為釀造的最小功能單元，并代表優(yōu)勢OTUs解剖窖泥樣品的細菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性，可分析新窖池與成熟窖池形成釀造質(zhì)量差異的原因。

Bacteroidetes微生物在新窖泥樣品LCX中的相對豐度為31.59%，屬于絕對優(yōu)勢類群，而在成熟窖泥樣品中相對豐度相對較低，分別為28.33%（YRF）、15.53%（XJF）、2.09%（CXF）。Bacteroidetes的參考物種來源于5個屬（表2），均具備代謝糖類物質(zhì)產(chǎn)生小分子酸的能力[12-17]，對寡聚糖、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子具有良好的底物特異性，其代謝活動在維持自身繁殖的同時，也為下游微生物的生長提供基礎(chǔ)性的能源、碳源、氮源等小分子物質(zhì)[13-16]，是窖泥釀造微生態(tài)中主導碳循環(huán)的重要微生物。

表2 優(yōu)勢操作分類單元矩陣的參考物種Table 2 Reference species of matrix of dominant operational taxonomic units

Spirochaetes門微生物在新窖泥樣品LCX中的相對豐度顯著低，只有0.07%，在成熟窖泥樣品中的相對豐度分別為15.92%（YRF）、4.78%（XJF）、1.43%（CXF），只包含planctomycete一個屬。planctomycete屬的微生物以CO2作為唯一碳源，在厭氧代謝過程將環(huán)境體系中有機物礦化、硝酸鹽的異養(yǎng)還原作用而產(chǎn)生的NH4+氧化成N2、NO2-或NO3-，并從中獲取繁殖所需的能量[18]，對窖泥釀造微生態(tài)的氮循環(huán)有促進作用。

Firmicutes門微生物被認為是窖泥釀造微生態(tài)中產(chǎn)酸產(chǎn)香的關(guān)鍵微生物，其豐度常被用來評價窖泥的質(zhì)量[4]。Firmicutes門微生物在窖泥樣品中的多樣性相對最豐富，主要包含芽孢桿菌綱（Bacilli）與梭菌綱（Clostridia），及相關(guān)的11個屬（表2）。窖泥樣品中的Bacilli微生物，主要包含乳桿菌屬（Lactobacillus），是代謝合成乳酸的主要微生物[19-21]，其相對豐度在新窖泥LCX中為23.20%，顯著高于成熟窖泥的0.97%（YRF）、2.41%（XJF）、3.25%（CXF）。窖泥樣品中的Clostridia微生物，特別是其中的梭菌屬（Clostridium），是窖池中合成己酸的釀造關(guān)鍵微生物[22-36]，其相對豐度在成熟窖泥中分別為36.01%（YRF）、51.26%（XJF）、73.95%（CXF），屬于絕對優(yōu)勢微生物。Clostridia微生物在新窖泥LCX中的相對豐度為21.05%，相對低于Bacilli微生物的相對豐度。已有研究表明[1，4]，窖池產(chǎn)己酸能力與Clostridia相對豐度為正相關(guān)，與Bacilli的相對豐度呈現(xiàn)負相關(guān)。Clostridia與Bacilli相對豐度在新窖泥LCX中為0.907 3%，顯著低于成熟窖泥的相對豐度37.041 6%（YRF）、21.287 9（XJF）、22.786 8（CXF）。可認為Clostridia微生物在新窖泥LCX中相對失調(diào)的豐度是導致新窖池所釀原酒主體香不突出，酒質(zhì)比成熟窖池差的主要原因。

3 結(jié)論

對新窖泥與成熟窖泥的細菌系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，螺旋菌門（Spirochaetae）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）是新窖泥與成熟窖泥中的共有優(yōu)勢類群，且Firmicutes微生物的多樣性相對最豐富；新窖泥中Bacilli微生物的相對豐度顯著高于成熟窖泥，Clostridia微生物與Bacilli微生物的豐度比顯著低于成熟窖泥。可見濃香型白酒成熟窖泥中“好窖出好酒”的典型細菌群落結(jié)構(gòu)，是Clostridia占絕對優(yōu)勢。以16S rRNA作為分子標記研究窖泥環(huán)境細菌群落，能有效揭示細菌系統(tǒng)發(fā)育的多樣性，但要充分了解窖泥微生物的代謝特征與釀造質(zhì)量的關(guān)系，還需借助微生物的可培養(yǎng)手段，并構(gòu)建窖泥微生物的miRNA表達庫，在后續(xù)再深入研究。