潘嵐君，姜 灝，趙桂紅，賈 黎，肖詩(shī)韻，付馨蕊，李燕軍*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

四氫嘧啶（ectoine）是一種環(huán)狀氨基酸衍生物，作為一種滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)，最早在光合細(xì)菌極端外硫紅螺菌（Ectothiorhodospira halochloris）中被發(fā)現(xiàn)[1]。四氫嘧啶受到環(huán)境脅迫條件（如高滲、干旱和極端溫度）的影響，并廣泛存在于嗜鹽細(xì)菌、嗜鹽古菌、真菌及鹽藻等細(xì)胞中[2-3]。由于其具有極強(qiáng)的大分子、細(xì)胞和組織保護(hù)能力，四氫嘧啶被認(rèn)為具有很高的商業(yè)價(jià)值[4-5]。目前主要應(yīng)用于護(hù)膚[6]和治療疾病方面[7-8]（如阿爾茨海默癥）。此外，四氫嘧啶還作為相容性物質(zhì)可用于加強(qiáng)酶和核酸等生物大分子的穩(wěn)定性，從而提高生物過(guò)程加工的效率[9-10]。

四氫嘧啶中含有一個(gè)手性碳原子，通過(guò)化學(xué)法合成困難且復(fù)雜，目前主要通過(guò)微生物發(fā)酵法合成。四氫嘧啶經(jīng)典的商業(yè)化生產(chǎn)方法是利用嗜鹽細(xì)菌——伸長(zhǎng)鹽單胞菌（Halomonas elongata）進(jìn)行[11]，該方法優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞可以反復(fù)利用，但操作復(fù)雜，成本較高。多年來(lái)，研究者們嘗試在常用的工業(yè)微生物中構(gòu)建四氫嘧啶合成途徑。BESTVATER T等[12]在大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中表達(dá)海生嗜鹽球菌（Marinococcus halophilus）的操縱子ectABC，實(shí)現(xiàn)了0.4 mmol/g細(xì)胞干質(zhì)量四氫嘧啶積累，由于使用了操縱子自身的啟動(dòng)子元件，仍然需要高鹽的誘導(dǎo)條件；NING Y K等[13]利用pTrc99a質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)伸長(zhǎng)鹽單胞菌（H.elongate）的操縱子ectABC，同時(shí)引入谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）解除反饋抑制的天冬氨酸激酶（lysC編碼）強(qiáng)化天冬氨酸-β-半醛的供應(yīng)，敲除高絲氨酸脫氫酶（thrA編碼）減弱代謝支路，失活乙醛酸循環(huán)的阻遏蛋白IclR，最終菌株在不需要高鹽的條件下積累25.1 g/L四氫嘧啶。

谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）是革蘭氏陽(yáng)性安全菌株，在氨基酸發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用了幾十年，尤其是利用谷氨酸棒桿菌年產(chǎn)百萬(wàn)噸級(jí)的谷氨酸和賴(lài)氨酸。由于四氫嘧啶和賴(lài)氨酸共用前體物為天冬氨酸-β-半醛，因此改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)四氫嘧啶可能具有較大的潛力。BECKER J等[14]在賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌LYS-1的基礎(chǔ)上表達(dá)伸長(zhǎng)鹽單胞菌（H.elongate）的操縱子ectABCD，四氫嘧啶積累量可達(dá)4.5g/L。PéREZ-GARCíA F等[15]以賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌DM1729為出發(fā)菌，通過(guò)pVWEx1質(zhì)粒表達(dá)來(lái)源于需鹽色鹽桿菌（Chromohalobacter salexigens）的操縱子ectABC，同時(shí)敲除全局調(diào)控基因sugR和乳酸脫氫酶基因ldhA，最終菌株產(chǎn)生22 g/L四氫嘧啶，但是操縱子ectABC的表達(dá)需要異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）的誘導(dǎo)。

本研究以野生型谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）ATCC 13032為研究對(duì)象，以賴(lài)氨酸積累量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)代謝工程手段強(qiáng)化天冬氨酸-β-半醛的供應(yīng)；然后敲除賴(lài)氨酸輸出蛋白基因lysE，組成型表達(dá)不同來(lái)源的四氫嘧啶操縱子ectABC，促進(jìn)天冬氨酸-β-半醛流向四氫嘧啶的合成。本研究將為開(kāi)發(fā)常規(guī)工業(yè)微生物生產(chǎn)四氫嘧啶、替代現(xiàn)行的嗜鹽菌復(fù)雜工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶XbaI、KpnI、HindIII、BamHI，PrimerSTAR HS 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：大連TaKaRa公司；DNA Marker：北京博邁德科技發(fā)展有限公司；2×TaqMaster Mix、ClonExpressTMII（重組酶）：諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA直接回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒：美國(guó)Omega Bio-TeK公司；硫酸卡那霉素、硫酸鏈霉素、氯霉素：美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

腦心浸液液體培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）：腦心浸液肉湯37.5 g/L，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

腦心浸液固體培養(yǎng)基：在BHI液體培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加抗生素，其中大腸桿菌硫酸卡那霉素工作質(zhì)量濃度為50 μg/mL，氯霉素工作質(zhì)量濃度為30 μg/mL；谷氨酸棒桿菌硫酸卡那霉素工作質(zhì)量濃度為10 μg/mL，氯霉素工作質(zhì)量濃度為12 μg/mL，鏈霉素工作質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，維生素B1（vitamin B1，VB1）0.5 mg/L，VH 0.1 mg/L，酵母粉5 g/L，玉米漿30 mL/L（400 g/L，121 ℃、20 min單獨(dú)滅菌），豆粕水解液15 mL/L，pH 7.0～7.2。115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，（NH4）2SO48 g/L，KH2PO41.6 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VB10.5 mg/L，VH 80 μg/L，蛋氨酸0.5 g/L，谷氨酸1 g/L，玉米漿35 mL/L（400 g/L，121 ℃、20 min單獨(dú)滅菌），豆粕水解液20 mL/L，pH 7.0～7.2。115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GL20A高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；ZWYR-D2403搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；PTC-1148聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、ScanDrop 100核酸定量分析儀：美國(guó)BIO-RAD公司；DYYIII2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠(chǎng)；Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；Eporator電擊轉(zhuǎn)化儀：德國(guó)Eppendorf公司；752分光光度計(jì)：上海分析儀器廠(chǎng)；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市科學(xué)儀器廠(chǎng)；SS-325全自動(dòng)滅菌鍋：日本TOMY儀器有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：廣東醫(yī)療器械廠(chǎng)；Agilent 1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究所用的引物見(jiàn)表2。質(zhì)粒構(gòu)建以E.coliDH5α為克隆宿主。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表

過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pXtuf-ectABC的構(gòu)建：分別以施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）ATCC 17588的基因組和pTrcECT質(zhì)粒[13]為模板，擴(kuò)增目的片段PSectABC和HEectABC。同時(shí)委托金唯智公司根據(jù)谷氨酸棒桿菌偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成，獲得PSectABCopt和HEectABCopt基因片段。擴(kuò)增目的基因時(shí)在引物上添加與載體線(xiàn)性化后兩側(cè)同源的序列。用限制性核酸內(nèi)切酶Hind III和BamH I酶切pXtuf質(zhì)粒，得到線(xiàn)性化載體。利用同源重組的方法將目的基因和線(xiàn)性載體連接，獲得ectABC操縱子過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pXtuf-PSectABC、pXtuf-PSectABCopt、pXtuf-HEectABC和pXtuf-HEectABCopt。菌落PCR用pXtuf質(zhì)粒上Ptuf-ident引物和相應(yīng)目的片段的下游引物鑒定，并送至金唯智公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

基因組編輯pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒的構(gòu)建：分別擴(kuò)增基因組編輯位點(diǎn)的上下游同源臂、啟動(dòng)子片段和目的基因片段，各片段通過(guò)引物設(shè)計(jì)包含依次同源的序列，借助重疊PCR方法將各片段連接起來(lái)。同時(shí)用XbaI和KpnI雙酶切pK18mobrpsL進(jìn)行載體線(xiàn)性化。利用同源重組的方法將重疊片段和線(xiàn)性載體連接，獲得pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒。菌落PCR鑒定采用通用引物M13-47和RV-M進(jìn)行。

基因擴(kuò)增PCR體系：5×Buffer 20 μL；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol）8 μL；引物1和引物2各4 μL；模板DNA（200～500 ng/μL）1 μL；Primer STAR HS DNA聚合酶1 μL；用雙蒸水補(bǔ)至100 μL。

基因擴(kuò)增PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火（復(fù)性）30 s；72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

菌落PCR體系：雙蒸水6.5 μL；引物1和引物2各0.5 μL；2×TaqMaster Mix 7.5 μL。

菌落PCR程序：95 ℃預(yù)變性8 min；98 ℃變性30 s；55 ℃退火（復(fù)性）30 s；72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

1.3.2 菌株構(gòu)建

谷氨酸棒桿菌基因組編輯采用作者團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的基于卡那霉素和鏈霉素篩選的兩次同源交換技術(shù)[16]。菌株構(gòu)建方法如下：將pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有10 μg/mL卡那霉素的BHI固體平板上，32 ℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后用相應(yīng)的鑒定引物ident-F和RV-M（或M13-47和ident-R）鑒定，若有大小符合預(yù)期的條帶則表示發(fā)生了一輪交換；隨后將鑒定正確的單交換菌落接入含有卡那霉素的BHI搖管中，于32 ℃培養(yǎng)12 h后稀釋涂布到含有50 μg/mL鏈霉素的平板上，待長(zhǎng)出菌落后用相應(yīng)的引物對(duì)ident-F和ident-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，若條帶大小符合預(yù)期則表示第二輪交換成功。提取基因組、擴(kuò)增相應(yīng)片段并進(jìn)行測(cè)序，最終確定獲得正確的基因組編輯菌株。

過(guò)表達(dá)菌株的獲得為將相應(yīng)的pXtuf-ectABC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含12 μg/mL氯霉素的BHI平板上，用構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)使用的引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

菌種活化：用接種環(huán)從保菌管中取一環(huán)劃線(xiàn)接種于BHI固體培養(yǎng)基，32 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)20～24 h，即得到一代活化菌種。然后用接種環(huán)取一環(huán)菌體接種于另一支試管斜面，32 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)12 h，得到二代活化菌種。

種子搖瓶培養(yǎng)：取活化好的二代試管斜面，用接種環(huán)刮取表層菌體，接種到裝液量為30 mL/500 mL種子培養(yǎng)基中，置于往復(fù)旋轉(zhuǎn)式搖床上，200 r/min、32 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12～14 h，測(cè)定OD600nm值。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：按10%（V/V）的接種量將種子液接入裝液量為30 mL/500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于往復(fù)旋轉(zhuǎn)式搖床上，200 r/min、32 ℃條件下培養(yǎng)，定期測(cè)定OD600nm值，發(fā)酵48 h結(jié)束，取樣測(cè)定賴(lài)氨酸或四氫嘧啶的質(zhì)量濃度。

1.3.4 測(cè)定方法

賴(lài)氨酸質(zhì)量濃度測(cè)定：取適量發(fā)酵液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min 離心2 min后取上清，用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)備用，經(jīng)2,4-二硝基氟苯衍生后過(guò)濾0.2 μm濾膜，進(jìn)樣HPLC檢測(cè)，其色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA氨基酸分析柱（150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相A：50%（V/V）的乙腈溶液，流動(dòng)相B：50 mmol/L乙酸鈉溶液，流動(dòng)相A和B的比例為1∶1（V/V），流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積設(shè)置為10 μL。

四氫嘧啶質(zhì)量濃度測(cè)定：采用Agilent 1100高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，其色譜條件：色譜柱為Phenomenex Gemini 5u C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為2%乙腈，單泵模式，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積設(shè)置為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 以賴(lài)氨酸積累量為評(píng)價(jià)指標(biāo)強(qiáng)化天冬氨酸-β-半醛的合成途徑

以鏈霉素抗性谷氨酸棒桿菌野生菌株出發(fā)構(gòu)建四氫嘧啶生產(chǎn)菌，為了增強(qiáng)前體物天冬氨酸-β-半醛的代謝流，以賴(lài)氨酸積累量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試。谷氨酸棒桿菌的賴(lài)氨酸代謝工程改造策略相對(duì)已經(jīng)成熟[17]，其中丙酮酸羧化酶（pyc編碼）、天冬氨酸激酶（lysC編碼）和高絲氨酸脫氫酶（hom編碼）催化的途徑為關(guān)鍵步驟[18]。為了解除草酰乙酸和天冬氨酸對(duì)丙酮酸羧化酶的反饋抑制，首先點(diǎn)突變pyc基因[17]，引入丙酮酸羧化酶P458S突變體，然后將pyc啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子Psod，獲得菌株LYS-1。天冬氨酸激酶催化的反應(yīng)是天冬氨酸組氨基酸合成的關(guān)鍵位點(diǎn)，受到賴(lài)氨酸、蘇氨酸等產(chǎn)物的反饋抑制[19]。通過(guò)突變lysC基因引入C932T突變體，然后將基因lysC啟動(dòng)子替換為Psod啟動(dòng)子，同時(shí)將起始密碼子GTG改為ATG，在解除天冬氨酸激酶反饋抑制的同時(shí)強(qiáng)化其表達(dá)，獲得菌株LYS-2。高絲氨酸脫氫酶催化天冬氨酸-β-半醛生成高絲氨酸，進(jìn)入蘇氨酸和異亮氨酸的合成。作為競(jìng)爭(zhēng)天冬氨酸-β-半醛的重要代謝支路，高絲氨酸脫氫酶的弱化表達(dá)非常關(guān)鍵。與直接失活該酶構(gòu)件營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株相比，引入滲漏型表達(dá)突變體為更好的策略，因?yàn)槠湓跇O大上程度控制代謝支流的同時(shí)，避免在培養(yǎng)基中添加蘇氨酸等物質(zhì)（增加生產(chǎn)成本和使工藝復(fù)雜化）。引入高絲氨酸脫氫酶滲漏型突變體[18]，獲得菌株LYS-3。

對(duì)這3株菌進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)，48 h時(shí)取樣測(cè)定，3株谷氨酸棒桿菌強(qiáng)化天冬氨酸-β-半醛供應(yīng)的工程菌株的賴(lài)氨酸積累量見(jiàn)圖1。

圖1 3株谷氨酸棒桿菌強(qiáng)化天冬氨酸-β-半醛供應(yīng)的工程菌株的L-賴(lài)氨酸積累量Fig.1 L-lysine accumulation of 3 Corynebacterium glutamicum engineering strains fortified with aspartic acid-βsemialdehyde supply

由圖1可知，菌株LYS-1積累了3.02 g/L賴(lài)氨酸，出發(fā)菌株C.glutamicumstrpR的培養(yǎng)液中檢測(cè)不到賴(lài)氨酸的分泌，說(shuō)明強(qiáng)化丙酮酸羧化酶的表達(dá)，確實(shí)有助于賴(lài)氨酸的合成。與之相比，天冬氨酸激酶的改造菌株LYS-2的賴(lài)氨酸積累量大幅度提高，達(dá)到了25.05 g/L，可見(jiàn)突變天冬氨酸激酶發(fā)揮著重要的作用。在此基礎(chǔ)上，弱化高絲氨酸脫氫酶的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了賴(lài)氨酸的生成量。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)對(duì)野生菌株3個(gè)位點(diǎn)的理性改造，成功構(gòu)建了一株高產(chǎn)賴(lài)氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌株LYS-3，賴(lài)氨酸積累量為28.48 g/L，其流經(jīng)天冬氨酸-β-半醛的代謝流較為通暢，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。

2.2 引入異源基因構(gòu)建四氫嘧啶合成途徑

敲除菌株LYS-3的賴(lài)氨酸輸出蛋白基因lysE，獲得菌株LYS-4，作為表達(dá)異源四氫嘧啶合成的出發(fā)菌株。阻斷賴(lài)氨酸輸出通道后，賴(lài)氨酸無(wú)法排出細(xì)胞，胞內(nèi)積累賴(lài)氨酸也會(huì)反饋抑制賴(lài)氨酸合成的關(guān)鍵酶，使得天冬氨酸-β-半醛不會(huì)過(guò)量流向賴(lài)氨酸合成方向。從天冬氨酸-β-半醛合成賴(lài)氨酸的第一個(gè)酶（二氫吡啶二羧酸合酶）為關(guān)鍵酶，其受到賴(lài)氨酸的強(qiáng)烈反饋抑制作用[19]。為了對(duì)比施氏假單胞菌（P.stutzeri）和伸長(zhǎng)鹽單胞菌（H.elongate）四氫嘧啶合成操縱子的作用效果，分別從施氏假單胞菌（P.stutzeri）基因組上擴(kuò)增操縱子PSectABC，從pTrcECT質(zhì)粒[13]擴(kuò)增HEectABC，同時(shí)根據(jù)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成，獲得PSectABCopt和HEectABCopt。以含有Ptuf啟動(dòng)子的pXMJ19衍生質(zhì)粒pXtuf為框架，在谷氨酸棒桿菌LYS-4中分別表達(dá)這4個(gè)操縱子（PSectABC、PSectABCopt、HEectABC、HEectABCopt），得到菌株ECT-1、ECT-2、ECT-3、ECT-4。以攜帶空質(zhì)粒的菌株（菌株ECT-0）為對(duì)照，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

菌株ECT-0、ECT-1、ECT-2、ECT-3、ECT-4的生物量積累及四氫嘧啶產(chǎn)量分別見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 表達(dá)不同ectABC谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的生物量積累Fig.2 Biomass accumulation of Corynebacterium glutamicum strains expressing different ectABC in shake flask culture

圖3 表達(dá)不同ectABC谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的四氫嘧啶產(chǎn)量Fig.3 Ectoine production of Corynebacterium glutamicum strains expressing different ectABC in shake flask culture

由圖2可知，與對(duì)照相比，表達(dá)PS來(lái)源操縱子的菌株ECT-1和ECT-2在24 h前生長(zhǎng)變慢，但是24 h以后，菌株ECT-2的生物量呈現(xiàn)線(xiàn)性增長(zhǎng)的趨勢(shì)。表達(dá)HE來(lái)源基因的菌株ECT-3和ECT-4前期生長(zhǎng)與對(duì)照菌株相當(dāng)，后期生物量高于對(duì)照。

由圖3可知，操縱子ectABC來(lái)源相同的菌株，四氫嘧啶產(chǎn)量越低菌株生長(zhǎng)越好，可能由于基因表達(dá)效率存在差異，導(dǎo)致質(zhì)粒的負(fù)荷不同。另外，四氫嘧啶為相容性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)性，也可能是影響菌株生長(zhǎng)性能的一個(gè)原因。表達(dá)異源四氫嘧啶操縱子的谷氨酸棒桿菌均積累了一定濃度的四氫嘧啶。然而，密碼子優(yōu)化大幅降低了其產(chǎn)量。未進(jìn)行密碼子優(yōu)化的菌株ECT-1和ECT-3均產(chǎn)生了高質(zhì)量濃度的四氫嘧啶，其中菌株ECT-3（表達(dá)HEectABC）的四氫嘧啶產(chǎn)量最高，達(dá)到17.21 g/L。由于ectABC為操縱子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行PSectABC密碼子優(yōu)化時(shí)并未改變后兩個(gè)基因的RBS區(qū)。對(duì)于HEectABC，后兩個(gè)基因區(qū)也可能各自帶有啟動(dòng)子區(qū)（類(lèi)似于海生嗜鹽球菌的情況[12]），對(duì)基因間隔序列也無(wú)優(yōu)化。盡管如此，兩組密碼子均導(dǎo)致四氫嘧啶產(chǎn)量大幅降低，優(yōu)化后基因可能導(dǎo)致操縱子基因或轉(zhuǎn)錄的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響基因表達(dá)。

2.3 強(qiáng)化天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NADPH再生途徑

3株過(guò)表達(dá)基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的四氫嘧啶產(chǎn)量比較結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒桿菌搖瓶培養(yǎng)的四氫嘧啶產(chǎn)量Fig.4 Ectoine production of Corynebacterium glutamicum overexpressing gene aspC and ECpntAB in shake flask

由圖4可知，將天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因aspC的啟動(dòng)子替換為Psod，菌株ECT-5四氫嘧啶的產(chǎn)量提高了19.7%。由于生產(chǎn)1分子四氫嘧啶需要消耗3分子還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），因此，在基因組整合表達(dá)了來(lái)自大腸桿菌的轉(zhuǎn)氫酶（pntAB編碼），結(jié)果表明四氫嘧啶產(chǎn)量進(jìn)一步提高6.1%，達(dá)到21.85 g/L。表達(dá)大腸桿菌pntAB增強(qiáng)NADPH供應(yīng)為代謝工程改造的有效策略[20-21]，本研究中也促進(jìn)了合成過(guò)程高需求NADPH的四氫嘧啶的生產(chǎn)。

天冬氨酸-β-半醛為天冬氨酸族產(chǎn)物合成的關(guān)鍵中間代謝物，強(qiáng)化其合成代謝流是保證四氫嘧啶高產(chǎn)的重要因素。從天冬氨酸-β-半醛出發(fā)，過(guò)表達(dá)2,4-二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（ectB編碼）也可以合成重要化合物2,4-二氨基丁酸，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物材料方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[22]。引入DABA脫羧酶可以進(jìn)一步延伸至產(chǎn)品1,3-丙二胺[23]，二胺是合成聚氨酯、尼龍的單體物質(zhì)，還包括腐胺（1,4-丁二胺）[24]和尸胺（1,5-戊二胺）[25]等。

3 結(jié)論

本研究以谷氨酸棒桿菌野生菌株ATCC 13032為出發(fā)菌株，通過(guò)理性代謝工程策略構(gòu)建了四氫嘧啶高效生產(chǎn)菌株，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)21.85 g/L，接近目前報(bào)道的最高水平。結(jié)果表明，以賴(lài)氨酸積累量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以有效將細(xì)胞代謝流導(dǎo)向天冬氨酸-β-半醛，為其衍生物合成奠定基礎(chǔ)。表達(dá)異源操縱子基因時(shí)，密碼子優(yōu)化可能會(huì)帶來(lái)不利影響。研究結(jié)果為四氫嘧啶等天冬氨酸-β-半醛衍生物的合成提供參考。后續(xù)將進(jìn)行系統(tǒng)代謝工程改造，提升菌株四氫嘧啶生產(chǎn)性能，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室水平發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化研究。