余 萍，張春宇，矯艷平*，徐長隆，呂雪鑫，趙 迪，閔祥博

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧 沈陽 110000）

益生乳酸菌是對人體健康有益的活性微生物，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，合成多種維生素（如維生素B1、維生素B2、維生素B6、葉酸、煙酸、維生素B12等）供人體所需，促進機體對蛋白質(zhì)的消化與吸收，促進機體對鈣、鐵、維生素D的吸收等[1]。雙歧桿菌（Bifidobacterium）是由法國巴斯德研究院的TISSIER于1899年首先在母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出來的專性厭氧菌，是健康動物腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌種，其數(shù)量隨年齡而變化，且與機體內(nèi)許多生理病理變化關系密切[2]。雙歧桿菌被認為是人類和其他溫血動物腸道中的關鍵微生物屬[3-4]。動物雙歧桿菌乳亞種即乳雙歧桿菌[5-7]，是腸道中最典型的有益菌，具有促進腸道健康[8-9]、提高免疫力[10-12]、抑制有害菌生長[13]、預防腸道有關疾病[14]等多種生理功能，可以作為發(fā)酵劑或原料應用于食品領域，如微生態(tài)制劑、雙歧桿菌果汁飲料、乳制品、保健食品及其他益生菌產(chǎn)品中。

動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002具有優(yōu)良的耐逆環(huán)境能力及緩解乳糖不耐受、降甘油三酯等益生特性，但具有較好的存活能力和較高的活菌數(shù)是益生菌發(fā)揮作用的基礎，適合的培養(yǎng)條件是其實現(xiàn)高活菌數(shù)培養(yǎng)的關鍵。培養(yǎng)基作為菌體所處的直接環(huán)境，不但為菌體生長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還會參與到菌體細胞內(nèi)的多種代謝過程，因此培養(yǎng)基成分必須具有細胞膜通透性，同時可以為細胞生長提供能量，并提供碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水等基礎生長元素[15]。陳夷平[16]通過對羅伊氏乳桿菌IMAU10281的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后，獲得了108CFU/mL的菌體密度，是優(yōu)化前的6.81倍。陳百瑩等[17]對植物乳桿菌ZJ316的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，菌體密度達到了9.28×109CFU/mL。

本研究以動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002為研究對象，以菌泥收率為考察指標，通過單因素及正交試驗優(yōu)化其發(fā)酵工藝；以活菌數(shù)為響應值，通過單因素試驗及Box-Behnken試驗設計優(yōu)化其培養(yǎng)基組成，為實現(xiàn)其凍干菌粉的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及其在益生菌發(fā)酵產(chǎn)品中的應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002：篩選自2月齡健康順產(chǎn)男嬰糞便，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.19509。

1.1.2 化學試劑

FP103酵母蛋白胨、FM902酵母浸出物：安琪酵母股份有限公司；無水葡萄糖：食藥集團圣雪葡萄糖有限責任公司；無水乙酸鈉、磷酸二氫鉀、一水硫酸錳、七水硫酸鎂：江蘇科倫多食品配料有限公司；吐溫80：江蘇四新界面劑科技有限公司；Hilmar5000乳糖：天津銀河偉業(yè)進出口有限公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS改良培養(yǎng)基：酵母蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉10.0g/L，酵母浸出物10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DHP-360/420電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；721型可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-10CA生物顯微鏡：上海佑科儀器儀表有限公司；DZKWS-8電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16M低溫高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LAI-3DT厭氧工作站：上海龍躍儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種保存

挑取動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002單菌落，接種于5 mL MRS改良培養(yǎng)基中，39 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，以5%（V/V）接種量轉接于200 mL MRS改良培養(yǎng)基中，39 ℃靜置培養(yǎng)16 h，將200 mL菌懸液離心（12 000 r/min、10 min）后取菌泥，加入8 mL MRS改良培養(yǎng)基和12 mL 50%甘油，分裝于凍存管中（1 mL/支），-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 菌種種子液制備

將動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002菌種凍存管放入37 ℃水浴鍋內(nèi)進行菌種復蘇15～30 s，將凍存管內(nèi)菌種1 mL接種至10 mL MRS改良培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)17 h，獲得種子液。

1.3.3 菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液初始pH值和接種量是影響乳酸菌高活菌數(shù)培養(yǎng)的重要因素[18-20]，因此試驗選擇這3個因素對菌株HCS04-002的發(fā)酵工藝優(yōu)化。取種子液以一定的接種量轉接到80 mL MRS改良培養(yǎng)基中，一定溫度下靜置培養(yǎng)17 h后，測定發(fā)酵液的pH和菌泥收率，分別單獨考察發(fā)酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）和初始pH值（6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）對菌泥收率的影響，其計算公式如下：

（2）正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，以發(fā)酵溫度、初始pH值和接種量為影響因素，以發(fā)酵液菌泥收率為評價指標，采用3因素3水平正交試驗設計L9（33）進行正交試驗，正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化

（1）單因素試驗

將冷凍菌種復蘇后，接種至MRS改良培養(yǎng)基中經(jīng)過活化后轉接到300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基中固定成分添加量為低聚果糖5 g/L，L-蘋果酸5 g/L，檸檬酸2 g/L，氯化鈣0.5 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，考察不同添加量的酵母蛋白胨（0、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L）、酵母浸出物（10 g/L、20 g/L、30g/L、40g/L、50g/L）、葡萄糖（0、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L）、乳糖（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）對菌株發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的方法進行菌落計數(shù)。

（2）響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，依據(jù)Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken試驗設計原理，選擇酵母蛋白胨（A）、酵母浸出物（B）、葡萄糖（C）、乳糖（D）添加量為考察因素，以菌懸液活菌數(shù)（Y）為響應值，進行4因素3水平的試驗設計，以確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表2。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation medium optimization

1.3.5 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。通過Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型進行方差分析和可靠性分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

發(fā)酵溫度、接種量及初始pH值對菌懸液菌泥收率的影響見圖1。由圖1a可知，當發(fā)酵溫度在33～39 ℃時，隨著溫度的升高菌泥收率逐漸升高；當發(fā)酵溫度為39 ℃時，菌泥收率達到最高，為0.847%；當發(fā)酵溫度高于39 ℃之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳發(fā)酵溫度為39 ℃。由圖1b可知，當接種量在1%～3%時，菌泥收率隨之逐漸升高；當接種量為3%時，菌泥收率達到最高，為0.820%；當接種量＞3%之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳接種量為3%。由圖1c可知，當初始pH值在6.8～7.2時，菌泥收率隨之逐漸升高；當初始pH值為7.2時，菌泥收率達到最高，為0.828%；當初始pH值＞7.2之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳初始pH值為7.2。

圖1 發(fā)酵溫度（a），接種量（b）及初始pH值（c）對發(fā)酵液菌泥收率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature (a),inoculum (b) and initial pH value (c) on bacterial sludge yield of fermentation broth

2.1.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、初始pH值（C）為自變量，以菌泥收率為考察指標，進行3因素3水平正交試驗設計，正交試驗結果與分析見表3。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation technology optimization

由表3可知，根據(jù)R值可知，影響菌泥收率的因素順序為A＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞初始pH值＞接種量。由k值可知，最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A3B2C2，即發(fā)酵溫度39 ℃，接種量3%，初始pH值7.2。按此培養(yǎng)條件對動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002進行發(fā)酵培養(yǎng)，重復試驗3次，菌泥收率平均值達1.07%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

考察酵母蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、乳糖添加量4個因素對活菌數(shù)的影響，考察其中1個因素時其他3個因素的水平固定為水平中間值，試驗結果見圖2。由圖2可知，酵母蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、乳糖4個因素對活菌數(shù)的影響均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當酵母蛋白胨添加量為20 g/L時發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為2.0×109CFU/mL；當酵母蛋白胨添加量＞20 g/L，發(fā)酵液活菌數(shù)下降。因此，最佳酵母蛋白胨添加量為20 g/L。當酵母浸出物添加量為20 g/L時，發(fā)酵液活菌數(shù)達到最高，為2.1×109CFU/mL；隨著酵母浸出物添加量的繼續(xù)增加，發(fā)酵液活菌數(shù)下降。因此，最佳酵母浸出物添加量為20 g/L。當葡萄糖添加量為10 g/L時，發(fā)酵液活菌數(shù)達到最高，為2.2×109CFU/mL。因此，最佳葡萄糖添加量為10 g/L。乳糖添加量＜10 g/L時，活菌數(shù)隨乳糖添加量的增加而升高；當乳糖添加10 g/L時活菌數(shù)最高，為2.2×109CFU/mL；當乳糖添加量＞10 g/L時，發(fā)酵液活菌數(shù)反而下降。因此，最佳乳糖添加量為10 g/L。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗結果Fig.2 Results of single factor tests for fermentation medium optimization

2.2.2 響應面試驗

以單因素試驗結果為基礎，依據(jù)Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken試驗設計原理，選擇酵母蛋白胨（A）、酵母浸出物（B）、葡萄糖（C）、乳糖（D）添加量為考察因素，以菌懸液活菌數(shù)（Y）為響應值，進行4因素3水平的試驗設計，Box-Behnken試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化Box-Behnken試驗設計與結果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation medium optimization

續(xù)表

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表4試驗結果進行分析，得到二次多項回歸方程Y=2.68+0.25A-0.042B-0.067C+0.075D+0.100AB+0.000AC+0.20AD+0.28BC+0.050BD-0.075CD-0.33A2-0.24B2-0.56C2-0.59D2

由表5可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），說明該模型對動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002發(fā)酵培養(yǎng)的活菌數(shù)的分析和預測較精準，失擬項（P=0.593 4＞0.05），無顯著性差異。模型決定系數(shù)R2=0.788 5，校正決定系數(shù)R2Adj=0.577 0，說明該模型方程擬合度良好，可以較好的反應各因素之間的關系[21]。各因素的F值可評價該因素對響應值的影響，F(xiàn)值越大，表明該因素的影響越顯著[22-23]。因此，對活菌數(shù)的影響順序依次是酵母蛋白胨＞乳糖＞葡萄糖＞酵母浸出物。一次項A、二次項A2對活菌數(shù)有顯著影響（P＜0.05），二次項C2和D2對活菌數(shù)有極顯著影響（P＜0.01）。

響應面曲面的坡度反映該因素對活菌數(shù)影響的強弱程度[24，25]，等高線橢圓形表明變量間交互作用顯著，圓形則表明變量間交互作用不顯著[26]。各因素交互作用對結果影響的響應面及等高線結果見圖3。由圖3可知，相應曲面圖形的開口均向下，說明響應面范圍覆蓋了最大值所在的區(qū)域。等高線圖均呈規(guī)則的橢圓形，四個因素兩兩之間交互作用均顯著。

圖3 各因素交互作用對動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002活菌數(shù)的影響的響應面及等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of various factors on the viable bacterial count of Bifidobacterium animalis subsp. lactis HCS04-002

模型預測最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母蛋白胨24.13 g/L、酵母浸出物29.70 g/L、葡萄糖19.23 g/L、乳糖10.68 g/L，在此條件下，活菌數(shù)理論值為2.74×109CFU/mL。為了方便實際操作，將最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方修正為：酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此條件下進行5次平行驗證試驗，活菌數(shù)實際值為2.73×109CFU/mL，與理論值接近，說明該模型能準確反映各因素添加量的變化與活菌數(shù)之間的關系，該模型具有可靠性。

3 結論

本研究對動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）HCS04-002發(fā)酵條件進行優(yōu)化，首先以菌泥收率為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化動物雙歧桿菌乳亞種HCS04-002發(fā)酵工藝為：培養(yǎng)溫度39 ℃，接種量3%，初始pH值7.2。通過單因素試驗和響應面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液的活菌數(shù)達2.73×109CFU/mL，是MRS改良培養(yǎng)基及37 ℃培養(yǎng)活菌數(shù)（8.82×108CFU/mL）的3.10倍，達到增菌培養(yǎng)的目的。