黃 怡，鄧曉茜，鐘吉安，劉忠軍，侯強(qiáng)川，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北省石花釀酒股份有限公司，湖北 襄陽 441705）

白酒根據(jù)香型主要分為12種，清香型白酒是其中的一種，以山西汾酒為代表。白酒不僅歷史文化悠久，同時其獨(dú)特的生產(chǎn)發(fā)酵工藝還賦予了白酒以酯類為主體的復(fù)合香味[1-2]。清香型白酒的主體香味物質(zhì)是乙酸乙酯和乳酸乙酯，主要合成途徑分別是酵母菌代謝與酸和醇在酯化酶作用下的化學(xué)合成，這兩種途徑都需要微生物的參與[3]。清香型白酒發(fā)酵階段包括大茬發(fā)酵和二茬發(fā)酵兩個階段[4]，不同發(fā)酵階段的發(fā)酵工藝均存在差異。因此，不同發(fā)酵條件下酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，對酒的品質(zhì)也會造成一定的影響。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)具有成本低、通量高和結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)勢[5]，廣泛應(yīng)用于渣豆醬[6]、豆豉[7]、大頭菜[8]、酸奶[9]以及各種香型白酒[10-12]發(fā)酵基質(zhì)的微生物類群解析。陳雪等[13]對陜西鳳香型白酒發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中共檢測出216個屬，其中細(xì)菌屬183個、真菌屬33個，酒醅中微生物真菌以Naumovozyma、根霉屬（Rhizopus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Canndida）、Pseudeurotium、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）和酵母屬（Saccharomyces）為主，細(xì)菌以乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和鏈霉菌屬（Streptomyces）為主；張雙燕等[14]對北京某清香型酒廠大曲中微生物多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中優(yōu)勢菌是乳酸菌，真菌中優(yōu)勢菌屬是Canndida、Aspergillus、毛霉屬（Mucor）、維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等；雷振河[15]分析了山西清香型白酒大曲及酒醅中微生物多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大曲中優(yōu)勢真核微生物主要包括Aspergillus、Thermoascus、Rhizopus、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和Canndida；酒醅中真菌主要包括Canndida和Pichia。這些研究均表明不同地區(qū)清香型白酒釀造微生物類群存在一定的差異，加之生態(tài)環(huán)境和制作工藝存在差異，其生產(chǎn)的白酒品質(zhì)與風(fēng)格也會有所差別。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對湖北省石花釀酒股份有限公司的清香型白酒大茬和二茬酒醅中真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，以期更加全面地了解大茬和二茬酒醅中真菌類群，為湖北襄陽地區(qū)釀酒微生物資源挖掘和后續(xù)白酒的發(fā)酵調(diào)控提供一定理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

酒醅：湖北省石花釀酒股份有限公司釀造車間。以高粱為主要原料，經(jīng)粉碎、高溫潤糝、糊化和出甑加漿后，按照糧食干質(zhì)量的10%接入低溫大曲，入缸發(fā)酵28 d，此時所取樣品即為大茬酒醅。大茬酒醅出缸拌輔料裝甑蒸餾后，加入等質(zhì)量低溫大曲入缸發(fā)酵21 d，此時所取樣品即為二茬酒醅。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：德國QIAGEN公司；Fast Pfu Buffer、Fast Pfu Fly DNA聚合酶（酶活5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix、5×TransStartTM：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物ITS4R/ITS3F、6×Loading Buffer：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96孔梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

于湖北省石花釀酒股份有限公司釀造車間選取20個地缸，其中10個為大茬發(fā)酵缸，10個為二茬發(fā)酵缸，地缸深度均為1.2 m，使用土壤采樣器深入酒醅表面約0.6 m處取樣品約500 g，將大茬酒醅樣品依次編號為DC1～DC10，二茬酒醅樣品依次編號為EC1～EC10。

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq高通量測序

參照試劑盒方法提取酒醅的宏基因組DNA，以其為模板，采用引物ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）對酒醅中真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）2區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[16]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將檢驗合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[17]中的方法進(jìn)行質(zhì)控，使用QIIME（version 1.9.1）分析平臺[18]對質(zhì)控后的序列進(jìn)行分析。采用PyNAST[19]軟件將序列對齊，按97%和100%相似性構(gòu)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣[20]，然后對每個OTU的代表性序列利用UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對[21]。

1.3.4 多元統(tǒng)計分析及圖表繪制

本研究對最小測序深度下的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)等α多樣性指標(biāo)進(jìn)行分析，同時基于UniFrac距離[22]使用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）對2種酒醅的真菌類群進(jìn)行β多樣性分析。使用曼-惠特尼秩和（Mann-Whitney）檢驗對單個指標(biāo)在2種酒醅中的差異性進(jìn)行分析，使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對2種酒醅樣品真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性進(jìn)行分析。使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用R軟件（v3.6.3）的Ggpubr和ggplot2軟件包繪制小提琴圖，使用Ggplot2和Reshape2軟件包繪制氣泡圖，使用Waterfall軟件包繪制瀑布圖，使用Origin 8.5繪制其他圖，部分?jǐn)?shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式進(jìn)行展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大茬及二茬酒醅樣品間α多樣性分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對20個酒醅樣品檢測共產(chǎn)生988 381條有效序列，平均每個樣品的有效序列為49 419條。在97%的相似度下，10個大茬酒醅樣品劃分了（2 297±197）個OTU，10個二茬酒醅樣品劃分了（1 828±398）個OTU。使用小提琴圖對2種酒醅樣品的α多樣性進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖1。

物種多樣性指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別用來評估樣本中微生物的豐度和多樣性[23]。由圖1可知，當(dāng)測序深度達(dá)到34 010條序列時，大茬和二茬酒醅真菌類群發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為（1 796±115）種和（1 497±107）種，香農(nóng)指數(shù)分別為4.97±0.50和3.70±0.27，經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)兩者差異均極顯著（P＜0.001），這說明大茬酒醅中真菌的豐富度和多樣性均高于二茬酒醅。

圖1 酒醅樣品發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（A）和香農(nóng)指數(shù)（B）比較的小提琴圖Fig.1 Violin diagram of comparison of observed species number (A)and Shannon index (B) of fermented grains samples

2.2 大茬及二茬酒醅樣品間β多樣性分析

β多樣性可反映不同環(huán)境中物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率[29]。基于UniFrac距離的加權(quán)和非加權(quán)主坐標(biāo)分析對20個酒醅樣品進(jìn)行空間排布，結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，將真菌相對含量和遺傳進(jìn)化關(guān)系均納入分析范疇時，第一主成分和第二主成分的累計方差貢獻(xiàn)率高達(dá)95.02%，大茬酒醅樣本分布在第一、三和四象限，二茬酒醅樣本集中分布在第二象限，2種樣本間無交疊現(xiàn)象。由圖2B可知，在僅考慮真菌類群遺傳進(jìn)化關(guān)系而不考慮各真菌相對含量時，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為17.24%，第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為5.83%，大茬酒醅樣本分布在第二和第三象限，二茬酒醅樣本分布在第一和第四象限。由此可定性認(rèn)為2種酒醅樣本間真菌群落存在較大差異，且大茬酒醅真菌類群的組間差異要大于二茬酒醅。本研究進(jìn)一步采用歐式距離對2種酒醅群落結(jié)構(gòu)組內(nèi)差異進(jìn)行計算，結(jié)果見圖3。

圖2 基于加權(quán)（A）和非加權(quán)（B）的UniFrac距離酒醅樣品的主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis of fermented grains samples based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

由圖3可知，大茬酒醅組內(nèi)各樣本間的歐式距離為0.044±0.010，而二茬酒醅組內(nèi)各樣本間的歐式距離為0.010±0.002，這可定量證明大茬酒醅樣本組內(nèi)差異性要比二茬酒醅樣本大。采用MANOVA檢驗亦發(fā)現(xiàn)，大茬酒醅樣品和二茬酒醅樣品真菌群落結(jié)構(gòu)整體上存在極顯著差異（P＜0.001），這與主坐標(biāo)分析結(jié)果一致。

圖3 基于歐式距離酒醅樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組間差異分析Fig.3 Analysis of between-group differences in fungal community structure of fermented grains samples based on Euclidean distance

2.3 基于OTU水平酒醅樣品真菌類群分析

經(jīng)兩步UCLUST劃分共得到17 543個OTU，將所有樣品中都存在的某一OTU定義為核心OTU。對樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)和核心OTU相對含量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，本研究中核心OTU共有134個，僅占總OTU數(shù)的0.76%，包含序列數(shù)856 136條，占總序列的86.62%。由此可見，大茬酒醅和二茬酒醅樣品中共有大量的核心OTU真菌類群。由圖4B可知，平均相對含量＞1.00%的核心OTU有6個，包含序列數(shù)占總序列數(shù)的68.85%，但OTU數(shù)僅占總OTU數(shù)的0.03%，分別為OTU6804（17.41%）、OTU4028（38.25%）、OTU4343（1.04%）、OTU1926（1.01%）、OTU1903（1.01%）和OTU12648（10.13%），其中OTU6804隸屬于熱子囊菌屬（Thermoascus），OTU4028和OTU4343隸屬于酵母屬（Saccharomyces），OTU1926隸屬于曲霉屬（Aspergillus），OTU1903隸屬于漢遜酵母屬（Hanseniaspora），OTU12648隸屬于覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），由此可見Saccharomyces、Thermoascus、Aspergillus、Hanseniaspora和Saccharomycopsis是襄陽地區(qū)清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢真菌。值得一提的是，有23個OTU僅存在于大茬酒醅樣品中，有1個OTU僅存在于二茬酒醅樣品中，其累計包含序列占總序列數(shù)的比例分別為2.36%和0.04%，其中17個鑒定為散囊菌目（Eurotiales）的分類單元，4個鑒定為酵母菌目（Saccharomycetales）的分類單元，1個鑒定為散囊菌綱（Eurotiomycetes）的分類單元，2個僅能鑒定為Ascomycota的分類單元。

圖4 酒醅樣品OTUs出現(xiàn)次數(shù)階梯圖（A）和核心OTUs相對含量瀑布圖（B）Fig.4 Ladder plot of OTUs occurrence frequency (A) and waterfall plot of the relative content of core OTUs (B) of fermented grains samples

2.4 基于門和屬分類學(xué)地位酒醅樣品的真菌類群分析

將平均相對含量＞1.00%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢真菌門或?qū)伲瑢⑵骄鄬浚?.00%的門或?qū)贇w并為“others”，將不能鑒定到門或者屬水平的序列歸并為“unclassified”。本研究中鑒定的真菌類群為3個門和32個屬，其中優(yōu)勢門僅1個，優(yōu)勢屬有5個。基于門和屬水平的2種酒醅真菌類群的分析結(jié)果見圖5。

由圖5A可知，大茬酒醅和二茬酒醅的優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量分別為99.82%和99.97%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，采集的2種酒醅樣品在門水平上差異均不顯著（P＞0.05）。有研究表明，子囊菌門不僅是清香型酒醅中優(yōu)勢真菌種群[24]，同樣也是濃香型[25]、醬香型白酒[26]及多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群。

由圖5B可知，大茬酒醅中平均相對含量＞1.00%的真菌屬分別為Thermoascus（33.77%）、Saccharomycopsis（22.60%）、Saccharomyces（13.51%）、Leiothecium（9.34%）、Aspergillus（4.19%）和Hanseniaspora（1.62%），二茬酒醅中為Saccharomyces（84.64%）、Saccharomycopsis（1.42%）和Thermoascus（1.30%）。經(jīng)Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，2種酒醅樣品中優(yōu)勢真菌屬含量均呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.001）。由圖5B亦可知，Thermoascus和Saccharomycopsis平均相對含量在大茬酒醅中顯著偏高（P＜0.01），而Saccharomyces平均相對含量在二茬酒醅中顯著偏高（P＜0.01）。襄陽地區(qū)大茬酒醅和二茬酒醅樣品真菌類群存在較大差異的原因，可能與原料和制作工藝的不同有關(guān)[27]。

圖5 基于門（A）和屬（B）分類學(xué)地位酒醅樣品的真菌類群分析Fig.5 Fungal community analysis of fermented grains samples based on the taxonomic status of phylum (A) and genus (B)

大茬酒醅和二茬酒醅的發(fā)酵周期一般為21～28 d，大茬酒醅發(fā)酵溫度遵循“前緩升、中挺、后緩落”的原則，由于二茬酒醅酸度較大，發(fā)酵溫度和大茬酒醅有所差別，一般遵循“前緊、中挺、后緩落”的原則。有研究表明，霉菌是具有糖化力的主要微生物，使酒曲具有發(fā)酵和生香的特殊香味[28]。賈麗艷等[29]研究了山西杏花村汾酒大茬酒醅和二茬酒醅發(fā)酵過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中真菌的種類和數(shù)量隨著發(fā)酵時間和環(huán)境的影響而變化，其中大茬酒醅發(fā)酵過程中Saccharomycopsis、Saccharomyces和Candida為優(yōu)勢種群，二茬酒醅中Saccharomycopsis、Hanseniaspora、青霉屬（Penicillium）、Aspergillus、范氏酵母屬（Vanderwaltozyma）和有孢圓酵母屬（Torulaspora）為主要優(yōu)勢菌群，該研究與本研究結(jié)果有所差別，可能是由于原料、制作工藝和地域氣候環(huán)境等綜合因素不同造成的。

3 結(jié)論

采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對石花清香型白酒大茬和二茬酒醅中真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大茬酒醅的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)與OTU數(shù)較高，豐富度和多樣性均高于二茬酒醅，且2種酒醅真菌類群存在明顯的差異。2種酒醅共有大量的核心OTU（134個）。在門水平上，2種酒醅的優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量分別為99.82%和99.97%。在屬水平上，大茬酒醅中優(yōu)勢真菌屬為熱子囊菌屬（Thermoascus）（33.77%）、腹膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（22.60%）、酵母屬（Saccharomyces）（13.51%）、Leiothecium（9.34%）曲霉菌屬（Aspergillus）（4.19%）和漢遜酵母屬（Hanseniaspora）（1.62%），二茬酒醅中優(yōu)勢真菌屬為（Saccharomyces）（84.64%）、Saccharomycopsis（1.42%）和Thermoascus（1.30%）。由此可見，雖然共有部分真菌類群，但2種酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。