劉汝婷，張 倩，郭西鵬，王金華，高 娃*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

L-乳酸是一種重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域。作為可生物降解的新材料——聚乳酸（polylactic acid，PLA）的主要原料，L-乳酸已經(jīng)成為目前最重要的有機(jī)酸之一[1-2]。由于其居高不下的生產(chǎn)成本，難以在價格上與傳統(tǒng)的塑料相競爭[3-4]。

我國是農(nóng)產(chǎn)品種植大國，每年產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈還有其他農(nóng)作物廢棄物較多[5]。數(shù)量巨大的小麥秸稈尚未進(jìn)行大規(guī)模有效的利用與開發(fā)，多采用焚燒處理造成環(huán)境污染，利用這些廉價的小麥秸稈可以代替糧食生產(chǎn)乳酸[6-7]。木質(zhì)纖維素經(jīng)過各種處理后，其水解液包含大量的葡萄糖和木糖[8-11]。因碳代謝阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CRR）[12-13]，即葡萄糖的存在會抑制其他糖的代謝，致使大腸桿菌（Escherichia coli）優(yōu)先利用葡萄糖，葡萄糖耗盡后才可利用其他糖類[14-15]，絕大多數(shù)的微生物無法利用水解液中的木糖。

為解除在利用木糖時存在的碳代謝阻遏效應(yīng)，有研究表明，可以通過基因工程技術(shù)對微生物進(jìn)行改造[16]，該阻遏效應(yīng)與磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶（phosphoenolpyruvate-sugarphos photransferase，PTS）系統(tǒng)密切相關(guān)[17]。PTS系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，同時將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，進(jìn)入糖酵解過程[18]。有研究報道，敲除PTS系統(tǒng)中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因ptsG來降低碳代謝阻遏效應(yīng)，進(jìn)而提高木糖的利用程度，提高糖酸轉(zhuǎn)化效率；半乳糖的相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也可以轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，通過敲除半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因mglB，也可降低碳代謝阻遏效應(yīng)，使重組大腸桿菌能夠同時利用葡萄糖和木糖[19]，如丁小云等[20]構(gòu)建的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因ptsG缺失乳酸工程菌可同時利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量為83.04 g/L；江吉雄[21]通過敲除半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因mglB，降低了混合糖發(fā)酵D-乳酸中的葡萄糖效應(yīng)，使發(fā)酵周期縮短了約40%，轉(zhuǎn)化率提高了2.3%；許瓊丹等[18]通過敲除mglB基因，降低了混合糖發(fā)酵乙醇中的葡萄糖效應(yīng)，使發(fā)酵周期縮短了約36%，轉(zhuǎn)化率提高了5.8%。

本研究以可高效利用葡萄糖產(chǎn)L-乳酸的大腸桿菌（E.coli）JH16為出發(fā)菌株，通過Red同源重組技術(shù)構(gòu)建ptsG/mglB雙基因缺陷菌株JH2705，以減弱葡萄糖效應(yīng)，提高混合糖中木糖的利用率，為基于木質(zhì)纖維素等可再生原料高效生產(chǎn)L-乳酸提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Stains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

CaCl2·2H2O、L-阿拉伯糖（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DL5 000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix：美國Fermentas公司；10×TE溶液、氨芐青霉素、卡那霉素（純度均為99%）：法國Mersco公司；PCR引物：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基[16]：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中添加1.5%～2%瓊脂粉。

抗性篩選培養(yǎng)基[16]：LB固體培養(yǎng)基中添加50 μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素。

種子培養(yǎng)基[16]：LB液體培養(yǎng)基中加入20 g/L葡萄糖或木糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基[16]：LB液體培養(yǎng)基加入56 g/L葡萄糖和24 g/L木糖。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MicroPluser電轉(zhuǎn)儀、My Cycler PCR儀：美國Bio-Red公司；Waters e2695型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Waters公司；Sartorius BB-8846880發(fā)酵罐：德國Sartorius Stedim Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物設(shè)計

根據(jù)ptsG和mglB基因序列設(shè)計敲除引物分別為△ptsGP1、△ptsG-P2、△mglB-P1、△mglB-P2，結(jié)果見表2。該對引物5'端堿基長度為45 bp的基因片段與ptsG和mglB基因序列同源，以18～20 bp（表中下劃線序列）與質(zhì)粒pkD4上FRT-kan-FRT閱讀框序列同源。

表2 本研究所用引物Table 2 Primes used in the study

1.3.2ptsG/mglB雙基因敲除大腸桿菌的構(gòu)建

以質(zhì)粒pkD4為模板，△ptsG-P1、△ptsG-P1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到帶有卡那霉素抗性基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次。

采用CaCl2法[22]將質(zhì)粒pkD46轉(zhuǎn)化入E.coliJH16的細(xì)胞中，通過氨芐青霉素抗性篩選培養(yǎng)基上篩選得到陽性單菌落。將陽性單菌落接種于含有1.6%L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)至OD600nm值=0.3～0.6，冰水浴30 min后，用去離子水洗滌4次后得到感受態(tài)細(xì)胞E.coliJH16/pkD46。

采用電轉(zhuǎn)法[19]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliJH16/pkD46中，涂布到卡那霉素抗性篩選培養(yǎng)基上。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑選生長良好的陽性單克隆在卡那霉素抗性篩選培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接1～2代，并用鑒定引物△ptsG-P3、△ptsG-P4進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將成功敲除ptsG基因的E.coliJH16命名為E.coliJH17。

敲除mglB基因方法與敲除ptsG基因方法相同。將成功敲除mglB基因的E.coliJH17命名為E.coliJH2705。

1.3.3 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)

挑取E.coliJH2705單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值至1.0～1.2左右，作為種子液。按2%（V/V）的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，定時取樣，測定菌體濃度光密度值（OD600nm值）、葡萄糖、木糖殘留量及乳酸產(chǎn)量，每個處理作三個平行。

1.3.4 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

一級種子液培養(yǎng)：挑取E.coliJH2705單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL，37 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)12 h。二級種子液培養(yǎng)：取20 mL一級種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為400 mL/1 L，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)到OD600nm值為1.0左右。將培養(yǎng)好的二級種子液按10%（V/V）的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為4 L/7 L發(fā)酵罐，37 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵72 h，發(fā)酵過程中采用3 mol/L的Ca（OH）2作為中和劑控制發(fā)酵液pH值為7.0。定時取樣，測定菌體濃度OD600nm值、葡萄糖、木糖殘留量及L-乳酸產(chǎn)量。

1.3.5 分析檢測

菌體濃度OD600nm值：采用紫外分光光度計在波長600 nm處測定菌液的吸光度值；葡萄糖、L-乳酸含量：采用生物傳感儀檢測法測定[23]；木糖含量：采用高效液相色譜分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌大腸桿菌JH2705的構(gòu)建結(jié)果

以鑒定引物△ptsG-P3和△ptsG-P4、△mglB-P3、△mglBP4對磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因ptsG（堿基長度為950 bp）和半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因mglB（堿基長度為910 bp）的敲除結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。由圖1可知，E.coliJH16經(jīng)過菌落PCR擴(kuò)增后，出現(xiàn)堿基長度分別為950 bp和910 bp的基因片段，而敲除這兩個基因后的重組菌E.coliJH2705經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增后，無ptsG、mglB基因片段，說明重組菌E.coliJH2705中的ptsG、mglB基因已經(jīng)成功被敲除。

圖1 ptsG/mglB基因缺陷菌株Escherichia coli JH2705的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification result of ptsG and mglB genes deficient Escherichia coli JH2705

2.2 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

以小麥秸稈為代表的木質(zhì)纖維素水解液中，由纖維素水解得到葡萄糖約為60%，且半纖維素與木糖比大約為7∶3[24]，因此，本研究模擬小麥秸稈水解液組成，設(shè)定5.6%葡萄糖與2.4%木糖為發(fā)酵碳源，不同菌株對混合糖的發(fā)酵效果見表3。由表3可知，E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705三菌株在72 h內(nèi)可發(fā)酵完畢，與出發(fā)菌E.coliJH16相比，E.coliJH2705的葡萄糖殘?zhí)橇浚?8.7 g/L）增加，葡萄糖消耗速率（0.52 g/（L·h））降低33.3%，無木糖殘留，木糖消耗速率（0.36 g/（L·h））升高38.5%，乳酸生產(chǎn)強(qiáng)度（0.56 g/（L·h））提高33.3%。說明敲除ptsG和mglB基因后，碳代謝阻遏效應(yīng)減弱，提高木糖消耗速率。

表3 Escherichia coli JH16、JH17、JH2705對混合糖發(fā)酵結(jié)果Table 3 Mixed sugar fermentation results of Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705

2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 生長曲線

E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705在7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵利用混合糖時的生長情況見圖2。由圖2可知，E.coliJH16、E.coliJH17及E.coliJH2705分別在發(fā)酵24 h、28 h、32 h時，OD600nm值達(dá)到最大（7.1、7.4、8.4）后進(jìn)入穩(wěn)定期。與E.coliJH16相比，E.coliJH17和E.coliJH2705的菌體生長更為明顯，表明敲除基因后的兩菌株可以攝取更多的碳源用于菌體生長[25]。

圖2 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705發(fā)酵利用混合糖時的生長曲線Fig.2 Growth curves of Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 in fermentation with mixed sugars

2.2.2 葡萄糖和木糖消耗曲線

E.coliJH16、E.coliJH17及E.coliJH2705在7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵利用混合糖時葡萄糖及木糖的消耗情況見圖3。由圖3可知，E.coliJH2705同時開始利用葡萄糖和木糖，發(fā)酵40 h時木糖消耗完畢，發(fā)酵至44 h時葡萄糖消耗完畢，而E.coliJH16優(yōu)先利用葡萄糖，發(fā)酵28 h時葡萄糖利用完畢，發(fā)酵30 h時開始利用木糖，至52 h還剩余7.1 g/L未被利用；E.coliJH17同時利用葡萄糖和木糖，發(fā)酵44 h時葡萄糖利用完畢，發(fā)酵至52 h時木糖剩余量為3.1 g/L。E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705消耗葡萄糖的速率分別為2.01 g/（L·h）、1.28g/（L·h）、1.20g/（L·h），消耗木糖速率分別為0.33 g/（L·h）、0.40 g/（L·h）、0.60 g/（L·h）。結(jié)果表明，ptsG基因的缺失，可有效降低分解代謝阻遏效應(yīng)，使得葡萄糖消耗速率降低，木糖消耗速率升高。而ptsG、mglB基因雙缺陷菌E.coliJH2705的木糖消耗速率比ptsG基因缺陷菌E.coliJH17提高50%，表明兩個基因?qū)δ咎抢眯噬呔哂携B加效應(yīng)。

圖3 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705發(fā)酵利用混合糖時木糖和葡萄糖消耗曲線Fig.3 Curves of xylose and glucose consumption in Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 fermentation with mixed sugars

2.2.3L-乳酸產(chǎn)量

E.coliJH16、E.coliJH17、E.coliJH2705的L-乳酸產(chǎn)量見圖4。由圖4可知，在發(fā)酵16 h之前，E.coliJH16的L-乳酸產(chǎn)量高于E.coliJH17、E.coliJH2705，E.coliJH17、E.coliJH2705同時利用葡萄糖和木糖產(chǎn)L-乳酸，但利用木糖的速率較慢，而E.coliJH16雖然不能利用木糖，但其利用葡萄糖產(chǎn)L-乳酸的速率卻大于E.coliJH17、E.coliJH2705利用葡萄糖和木糖產(chǎn)L-乳酸的速率之和；在發(fā)酵18 h后，E.coliJH17和E.coliJH2705的L-乳酸產(chǎn)量逐漸超過E.coliJH16，E.coliJH17和E.coliJH2705利用木糖產(chǎn)L-乳酸的能力遠(yuǎn)大于E.coliJH16。發(fā)酵至48 h時，E.coliJH16的L-乳酸產(chǎn)量為34.12 g/L，轉(zhuǎn)化率為42.0%，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.71 g/（L·h）；E.coliJH17的L-乳酸產(chǎn)量為53.22 g/L，轉(zhuǎn)化率為66.5%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.02 g/（L·h）；E.coliJH2705的L-乳酸產(chǎn)量為56.03 g/L，轉(zhuǎn)化率為70.0%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.27 g/（L·h）。與出發(fā)菌株E.coliJH16相比，重組菌株E.coliJH17、JH2705生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了43.9%、79.1%。重組菌株E.coliJH2705已消耗完所有碳源，而E.coliJH17、JH16分別剩余3.1 g/L、7.1 g/L的木糖。結(jié)果表明，敲除ptsG和mglB基因后，菌株的生產(chǎn)強(qiáng)度提高。

圖4 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705發(fā)酵混合糖產(chǎn)L-乳酸含量Fig.4 Contents of L-lactic acid produced by Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 fermented with mixed sugars

3 結(jié)論

本研究以大腸桿菌JH16為出發(fā)菌株，通過Red同源重組技術(shù)，同時敲除了磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因ptsG和半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因mglB，構(gòu)建ptsG/mglB雙基因缺陷型大腸桿菌JH2705。該菌株以8%混合糖（5.6%葡萄糖+2.4%木糖）為碳源發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸時，能同時利用葡萄糖和木糖，大幅度減小了葡萄糖效應(yīng)所帶來的不利影響，其木糖利用速率為0.60 g/（L·h），L-乳酸生產(chǎn)強(qiáng)度為1.27 g/（L·h），較出發(fā)菌株E.coliJH16分別提高50%、79.1%，并且E.coliJH2705的糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)70%，為木質(zhì)纖維度高效利用木糖提供一定的理論基礎(chǔ)。