譚 海，顧 陽，盧南巡，常景玲，2，李志剛，2*

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

異亮氨酸在1904年從甜菜漿中分離得到，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)與亮氨酸相似，理化性質(zhì)不同，被命名為異亮氨酸。異亮氨酸具有四種光學(xué)異構(gòu)體，但是在自然界中僅存在L-異亮氨酸[1]。L-異亮氨酸是人體必需氨基酸，是三種分支氨基酸之一，作為生物活性分子參與營養(yǎng)代謝和物質(zhì)合成，在食品、醫(yī)藥和飼料等方面的廣泛應(yīng)用[2]。早期L-異亮氨酸主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)[3]，但是，化學(xué)合成法產(chǎn)量低，合成過程使用強酸、強堿以及有機溶劑造成環(huán)境污染，漸漸淡出人們的視線，微生物發(fā)酵法受到廣泛關(guān)注。

目前，用于L-異亮氨酸生產(chǎn)的菌株主要包括黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）、大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在發(fā)酵過程中會合成內(nèi)毒素[4]，產(chǎn)物的分離純化技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本居高不下，工業(yè)化生產(chǎn)難以實現(xiàn)；黃色短桿菌在代謝工程改造方面的研究相對較少，隨著對谷氨酸棒桿菌認識的不斷深入，發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌更適合用于生產(chǎn)L-異亮氨酸。谷氨酸棒桿菌是公認的安全（generally recognized as safe，GRAS）菌株，廣泛應(yīng)用于氨基酸和核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)中[5]。L-異亮氨酸的生物合成途徑冗長且具有復(fù)雜精密的自我調(diào)節(jié)機制，通過隨機誘變可以獲得產(chǎn)量相對較高的突變菌株[6]，但其遺傳背景不明且很難通過誘變進一步提高產(chǎn)量。因此，通過代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-異亮氨酸越來越引起重視。2007年，YUKAWA H等[7]對谷氨酸棒桿菌進行全基因組測序，為谷氨酸棒桿菌代謝途徑的理論研究奠定了基礎(chǔ)。隨著對L-異亮氨酸代謝途徑、關(guān)鍵酶調(diào)控以及菌種選育等方面研究的不斷深入和基因工程技術(shù)的不斷進步，代謝工程逐漸替代經(jīng)典的隨機突變成為菌種改造的主要方法[8]。

在谷氨酸棒桿菌中，L-異亮氨酸生物合成途徑冗長，分支途徑較多，生物體自身調(diào)節(jié)機制精密復(fù)雜，導(dǎo)致主代謝流較弱，副產(chǎn)物大量產(chǎn)生，代謝調(diào)控較為困難。丙酮酸和α-酮基丁酸是L-異亮氨酸代謝途徑中兩個重要的節(jié)點，圍繞這兩個節(jié)點對相關(guān)酶編碼基因進行編輯，能夠有效的調(diào)節(jié)代謝流分配，強化主路代謝流強度，減少副產(chǎn)物合成。另外，嚴重的反饋抑制、氨基酸分泌能力不足、輔因子再生能力較弱等也嚴重制約著產(chǎn)物合成能力的提高。本文綜述了近年來代謝工程改造谷氨酸棒桿菌促進L-異亮氨酸生物合成的相關(guān)研究，主要涉及代謝通量調(diào)控、解除反饋抑制、調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）水平以及提高產(chǎn)物分泌能力等方面，對進一步改造菌株和促進L-異亮氨酸發(fā)酵合成具有一定的參考意義。

1 圍繞L-異亮氨酸合成途徑關(guān)鍵節(jié)點的代謝工程改造

在谷氨酸棒桿菌中，丙酮酸是新陳代謝中心的開關(guān)點。在糖酵解途徑（embden meyerhof pathway，EMP）通路和各種氨基酸代謝通路之間起著高度連接的樞紐作用，是合成代謝的基石。在L-異亮氨酸代謝途徑中（見圖1），丙酮酸主要存在4條去路：①在乙酰羥酸合酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS）催化下，與α-酮基丁酸縮合形成α-乙酰-α-羥基丁酸，進而在乙酰羥酸還原異構(gòu)酶（acetohydroxyacid isomerore ductase，AHAIR）、二羥酸脫水酶（dihydroxy acid dehydratase，DADH）、轉(zhuǎn)氨酶（transaminase，TA）等酶的作用下形成L-異亮氨酸；②在AHAS催化下，兩分子丙酮酸縮合形成α-乙酰乳酸，同樣在AHAIR、DADH、TA等酶的作用下合成L-纈氨酸和L-亮氨酸；③由基因pqo編碼的丙酮酸氧化還原酶催化產(chǎn)生乙酸鹽；④經(jīng)基因alaT編碼的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化形成丙氨酸。副產(chǎn)物的生成造成碳代謝流損失，降低L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。因此，在丙酮酸節(jié)點處，通過基因工程手段弱化副產(chǎn)物的合成途徑或提高碳代謝流在L-異亮氨酸合成途徑中的分配，能夠有效促進L-異亮氨酸的合成[3]。

圖1 L-異亮氨酸生物合成示意圖Fig.1 Schematic diagram for L-isoleucine biosynthesis

L-纈氨酸和L-亮氨酸作為主要副產(chǎn)物，生物合成時與L-異亮氨酸共用一套酶系，弱化這些酶的編碼基因表達或抑制酶活性，同時會影響L-異亮氨酸的合成[9]。研究表明，AHAS酶對α-酮基丁酸的親和力遠遠大于丙酮酸[10]，這一特點為進一步提高產(chǎn)物合成提供依據(jù)。強化α-酮基丁酸合成途徑，能夠使更多丙酮酸用于L-異亮氨酸的合成，降低副產(chǎn)物氨基酸的積累。徐慶陽等[11]通過過表達高絲氨酸脫氫酶基因thrA，增強α-酮基丁酸的合成，副產(chǎn)物賴氨酸積累量較出發(fā)菌株減少63.8%，L-異亮氨酸產(chǎn)量提高7.0%，達到36.5 g/L。PáTEK M等[12]從大腸桿菌（Escherichia coli）K12中成功擴增出thrABC基因（蘇氨酸操縱子），并在谷氨酸棒桿菌中表達。WANG J等[13]研究表明，在谷氨酸棒桿菌中過表達來自大腸桿菌的thrABC基因，促進α-酮基丁酸合成，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，L-異亮氨酸的產(chǎn)量提高5.3%，達到14.1 g/L。此外，提高蘇氨酸脫水酶代謝活性也是增強α-酮基丁酸合成的有效方法。DONG X等[14]在谷氨酸棒桿菌中過表達蘇氨酸脫水酶基因，利用該菌株進行發(fā)酵時，L-蘇氨酸完全耗盡，L-賴氨酸碳代謝通量降低83.0%，L-異亮氨酸產(chǎn)量達到3.5 g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量具有明顯提升。史建明等[15]在谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）YILW中過表達蘇氨酸脫水酶，使耗糖高峰期滯后，L-異亮氨酸合成途徑的代謝流提高8.5%，產(chǎn)量增加10.3%，達到32.0 g/L。

此外，減少乙酸和丙氨酸等副產(chǎn)物合成，也有利于產(chǎn)物的積累。研究發(fā)現(xiàn)，敲除alaT基因可以減少L-丙氨酸的合成，改變碳代謝流向，使更多的丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進入蘇氨酸合成途徑，進一步合成為L-異亮氨酸[13]。EIKMANNS B J等[16]通過敲除pqo基因使發(fā)酵過程中幾乎沒有乙酸的合成，導(dǎo)致丙酮酸的積累，促進三種分支氨基酸的合成。朱福周等[17]在谷氨酸棒桿菌中過表達pyc基因，提高丙酮酸羧化酶的表達量，使丙酮酸直接合成草酰乙酸，L-異亮氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高11.7%，達到24.8 g/L。

2 代謝工程改造解除反饋抑制促進L-異亮氨酸合成

谷氨酸棒桿菌合成L-異亮氨酸代謝途徑中存在嚴重的反饋抑制現(xiàn)象[3]。當L-異亮氨酸過量積累時，會抑制蘇氨酸脫水酶、乙酰羥酸合酶的活性[18-20]；而L-蘇氨酸積累時，會抑制高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶以及天冬氨酸激酶的活性，使α-酮基丁酸合成受阻，進而影響L-異亮氨酸的合成。通過代謝工程手段，解除反饋抑制，是促進L-異亮氨酸的代謝合成的有效方法[21]。

2.1 針對解除L-異亮氨酸反饋抑制的代謝工程改造

蘇氨酸脫水酶是L-異亮氨酸合成過程中的限速酶[3]，受到L-異亮氨酸反饋抑制，通過定點突變對該酶進行改造，緩解或解除反饋抑制有利于產(chǎn)物積累。GUO Y等[18]通過定點誘變技術(shù)在蘇氨酸脫水酶中分別引入V140M、F383A和V140M-F383A三個不同突變位點，酶的活性均得到明顯提高，在谷氨酸棒桿菌中過表達上述三種突變型酶蛋白，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別達到0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L，比出發(fā)菌株分別提高17.1%、34.0%和55.3%。YIN L等[19]對具有抗反饋抑制特性蘇氨酸脫水酶的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)突變后的蘇氨酸脫水酶中只有一個氨基酸被取代（Phe383Val），而酶的活性大大提高，表達菌株發(fā)酵產(chǎn)物比出發(fā)菌株提高33.9%。

乙酰羥酸合酶（AHAS）以二磷酸硫胺素為輔酶，催化兩分子丙酮酸縮合成乙酰羥酸，進而合成L-亮氨酸和L-纈氨酸；也可以催化丙酮酸與α-酮基丁酸反應(yīng)生成α-乙酰-α-羥丁酸，進而合成L-異亮氨酸[21-22]。AHAS是由兩個大亞基和兩個小亞基組成的四聚體[10]，大亞基負責酶的催化功能，小亞基負責酶的調(diào)節(jié)功能。L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸均能與AHAS的調(diào)節(jié)位點結(jié)合，引起酶構(gòu)象發(fā)生變化，從而抑制AHAS活性[3]。最近，LU J等[23]通過定點誘變技術(shù)，對AHAS調(diào)節(jié)亞基上的一些位點（N11S、T34I、A36V、T104S、N11F、G14E和N29H）進行定點誘變處理，獲得AHAS突變體對L-異亮氨酸敏感性顯著下降。YIN L等[19]在C.glutamicumJHI3-156中共表達具有抗反饋抑制特性的蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合酶的基因，L-異亮氨酸產(chǎn)量達到30.7 g/L。GUO Y等[24]對不同氨基酸生產(chǎn)菌株的AHAS進行分析，發(fā)現(xiàn)AHAS抗反饋抑制能力越強，菌株發(fā)酵氨基酸的產(chǎn)量也越高。

2.2 針對解除L-蘇氨酸反饋抑制的代謝工程改造

L-蘇氨酸是L-異亮氨酸合成途徑中重要的中間代謝物，對高絲氨酸脫氫酶（HD）、高絲氨酸激酶（HK）和天冬氨酸激酶（AK）等具有較強的抑制作用，通過代謝工程手段解除或緩解反饋抑制，有利于產(chǎn)物的合成[25-26]。REINSCHEID D J等[27]通過分析一株對L-蘇氨酸具有抗性突變株的hom基因，發(fā)現(xiàn)高絲氨酸脫氫酶中存在G378E突變，并指出此差異可能是解除反饋抑制的關(guān)鍵。進一步研究表明，氨基酸替換使該位點與L-蘇氨酸間的范德華力喪失，導(dǎo)致HD對L-蘇氨酸的親和力變?nèi)?，緩解對HD的反饋抑制。徐德雨等[28]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型谷氨酸棒桿菌相比，髙產(chǎn)菌株的AK存在G359D突變，使L-蘇氨酸與L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制得到有效緩解，10 mol/LL-蘇氨酸和L-賴氨酸同時存在的條件下，AK活性仍保留76.9%，而野生型菌株的AK酶活僅保留4.4%。YOSHIDA A等[29]利用定點突變技術(shù)，獲得AK的G277A突變體，導(dǎo)致L-蘇氨酸與AK調(diào)節(jié)亞基結(jié)合位點發(fā)生變化，二者無法結(jié)合形成二聚體，解除對AK的反饋抑制。CHEN Z等[30]利用定點誘變技術(shù)獲得14株AK突變菌株，經(jīng)驗證這些突變菌株對L-蘇氨酸均具有一定抗性。PETIT C等[31]通過定點誘變技術(shù)對HK進行處理，獲得一株突變體CglThrB-A20G，該突變株保留野生型菌株酶的活性，L-蘇氨酸與ThrB-A20G位點之間的范德華力喪失，從而解除L-蘇氨酸對HK的反饋抑制。

3 代謝工程改造提高胞內(nèi)NADPH水平促進產(chǎn)物合成

輔因子在細胞新陳代謝過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用，對某些代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要意義[32]。通過調(diào)節(jié)輔因子再生速率及比例，能夠改變代謝流分配和物質(zhì)合成。在谷氨酸棒桿菌中，NADPH是L-異亮氨酸合成途徑中ASD、HD、AHAIR、TA等諸多酶的輔酶，還是維持細胞內(nèi)氧化還原水平的重要物質(zhì)[33-34]。NADPH水平調(diào)節(jié)是影響L-異亮氨酸合成的重要因素[35]。

NADPH主要通過兩種途徑產(chǎn)生，一種是與特定反應(yīng)相偶聯(lián)將NADP+還原成NADPH，如磷酸戊糖途徑中zwf編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，基因gnd編碼的葡萄糖酸磷酸脫氫酶；另一種是通過基因ppnK表達NAD激酶的催化反應(yīng)，將NAD+或NADH磷酸化生成NADP+和NADPH[36]。SHI F等[34]分別在C.glutamicumJHI3-156和C.glutamicumATCC 13869中過表達ppnK基因，胞內(nèi)NADPH含量分別增加95.0%和42.0%，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別增加37.0%和24.0%。SHI F等[37]在C.glutamicumJHI3-156中過表達zwf和ppnK基因，胞內(nèi)NADPH水平得到顯著提升，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別增加26.0%和31.0%，將兩個基因共表達，菌株發(fā)酵72 h后，異亮氨酸產(chǎn)量提高至16.7 g/L。該研究還在C.glutamicumJHI3-156中表達源于釀酒酵母的NADH激酶基因（POS5），菌株發(fā)酵72 h，L-異亮氨酸產(chǎn)量達到16.2 g/L，而對照菌株產(chǎn)量僅為12.8 g/L。MA W等[38]通過過表達果糖-1,6-二磷酸酶基因gnd、fbp、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因pgl，強化谷氨酸棒桿菌的磷酸戊糖途徑，使L-異亮氨酸產(chǎn)量分別提高15.2%、13.6%、7.5%；以上三個基因共表達的菌株，在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h可產(chǎn)生28.9 g/L的L-異亮氨酸。BARTEK T等[39]研究發(fā)現(xiàn)，由基因pgi編碼的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的缺失可以為L-異亮氨酸合成提供充足的NADPH，提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。

4 代謝工程改造提高L-異亮氨酸轉(zhuǎn)運能力

L-異亮氨酸快速合成時，需要及時運送到胞外，否則在胞內(nèi)大量積累會降低相關(guān)酶活性，出現(xiàn)反饋抑制現(xiàn)象，影響產(chǎn)物的合成與積累[40]。谷氨酸棒桿菌可以通過brnQ編碼的BrnQ轉(zhuǎn)運蛋白從環(huán)境中攝取L-異亮氨酸[41]，當細胞內(nèi)L-異亮氨酸積累時，L-異亮氨酸可以結(jié)合全局調(diào)控因子Lrp，激活brnFE基因的表達，轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合體BrnFE將L-異亮氨酸分泌到胞外[36]。通過代謝工程手段降低L-異亮氨酸的攝取速率，提高分泌能力可以有效緩解反饋抑制，是促進產(chǎn)物合成的重要手段。

BrnQ轉(zhuǎn)運蛋白由426個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為44.9 kDa。TAUCH A等[42]研究發(fā)現(xiàn)，將染色體上的基因brnQ敲除后，L-異亮氨酸攝取速率僅為0.04 nmol/（min·mg干質(zhì)量），而野生型為1.20 nmol/（min·mg干質(zhì)量），攝取速率顯著降低。XIE X等[43]研究表明，利用C.glutamicumYILW△brnQ發(fā)酵生產(chǎn)時，35 h前L-異亮氨酸合成速率與對照菌株的相當，發(fā)酵結(jié)束，L-異亮氨酸產(chǎn)量比對照的提高16.6%，達到22.3 g/L。

BrnFE是一種針對脂肪族疏水氨基酸的滲透酶，對三種分支氨基酸的分泌速率大致相同。MUSTAFI N等[44]研究發(fā)現(xiàn)，敲除brnF或brnE后，L-異亮氨酸無法分泌到胞外，而過表達brnFE則使菌株獲得更強的分泌能力。XIE X等[43]利用C.glutamicumYILW/pXMJ19和YILW/pXMJ19-brnFE進行發(fā)酵生產(chǎn)實驗，發(fā)現(xiàn)二者菌體濃度相差不大，但YILW/pXMJ19-brnFE的發(fā)酵產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高28.2%（25.9 g/L），YILW△brnQpXMJ19-brnFE的發(fā)酵結(jié)果表明，L-異亮氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高43.6%（29.0 g/L）。

亮氨酸響應(yīng)蛋白Lrp是L-異亮氨酸分泌到胞外的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[45-46]。細胞內(nèi)存在高濃度L-異亮氨酸時，lrp基因被激活表達，L-異亮氨酸與蛋白Lrp結(jié)合激活brnFE基因，轉(zhuǎn)運蛋白BrnFE大量合成，將L-異亮氨酸轉(zhuǎn)運至細胞外[47]。CHEN C等[48]通過在C.glutamicumATCC 13869中過表達基因lrp，使L-異亮氨酸產(chǎn)量提高9倍。YIN L等[49]在谷氨酸棒桿菌中過表達基因lrp后進行搖瓶發(fā)酵實驗，與出發(fā)菌株相比，L-異亮氨酸產(chǎn)量增加31.9%，達到21.5 g/L；將基因brnFE和lrp共表達，使產(chǎn)量提高63.0%，達到26.6 g/L。因此，蛋白Lrp對L-異亮氨酸的分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用[50]。

表1 谷氨酸棒桿菌代謝工程改造及L-異亮氨酸發(fā)酵性能比較Table 1 Metabolic engineering modification and L-isoleucine fermentation performance comparison of Corynebacterium glutamicum

5 展望

L-異亮氨酸生物合成途徑冗長，分支途徑較多，生物體自身調(diào)節(jié)機制十分復(fù)雜，導(dǎo)致主代謝流較弱，副產(chǎn)物大量產(chǎn)生，代謝調(diào)控和改造較為困難。另外，嚴重的反饋抑制、氨基酸分泌能力不足、輔因子再生能力較弱等也嚴重制約著產(chǎn)物合成能力的提高。谷氨酸棒桿菌是L-異亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株之一，具有遺傳背景清楚，基因改造手段和工具成熟的特點，為通過代謝工程手段解決上述問題，提高L-異亮氨酸代謝合成提供了良好基礎(chǔ)。隨著各種組學(xué)技術(shù)的不斷進步，菌種的改造更加便捷。新興的系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)使細胞全基因組重編程得以實現(xiàn)[51]，可以快速、高效的重構(gòu)代謝通路，更方便的對目的基因進行改造[52]，為谷氨酸棒桿菌的改造提供有力手段。通過上述技術(shù)對谷氨酸棒桿菌進行改造，可以進一步促進L-異亮氨酸的合成與積累，將其提升為氨基酸工業(yè)中最成功的微生物。