齊敬宇 鄭亞光 郝 穎 趙艷麗 郭曉宇 郭詠梅 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

奶牛泌乳期高強(qiáng)度的代謝以及泌乳早期能量負(fù)平衡引起的脂肪動(dòng)員加強(qiáng)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基蓄積過(guò)多，從而造成免疫和抗氧化應(yīng)激功能及生產(chǎn)性能下降，尤其是高產(chǎn)奶牛[1]。本課題組前期研究結(jié)果得出高產(chǎn)奶牛的抗氧化指標(biāo)如總抗氧化能力(T-AOC)和總超氧化歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性顯著降低[2]。一氧化氮(NO)是具有簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)和小分子量的活性氮簇(RNS)自由基，其在機(jī)體中具有雙向調(diào)節(jié)的功能。研究表明，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO在體內(nèi)和體外均有神經(jīng)信號(hào)傳遞功能、抗菌和免疫作用。然而，NO的過(guò)量產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，使奶牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)是一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，能夠反映機(jī)體感染及疾病的發(fā)生，其抗氧化應(yīng)激能力與奶牛的抗氧化和免疫功能密切相關(guān)[4]。鄭亞光等[5]研究表明，NO過(guò)量會(huì)明顯引起奶牛PBMC的氧化應(yīng)激。因此，抑制奶牛PBMC中NO的蓄積是提高奶牛抗氧化能力、降低氧化損傷的主要途徑之一。

殼寡糖(COS)是一種由β-(1→4)-糖苷鍵連接的二氨基葡萄糖低聚物，具有水溶性、無(wú)細(xì)胞毒性、易被腸道吸收等特點(diǎn)，它是通過(guò)將殼聚糖進(jìn)行酸水解和酶降解得到的[6]。COS具有許多生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化和免疫刺激等，而且COS與殼聚糖具有相似的生物學(xué)活性和理化特性[7]。研究表明，COS對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，可以減少炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和NO的釋放和表達(dá)[8]。本課題組前期研究表明，COS對(duì)過(guò)量NO誘導(dǎo)的PBMC氧化應(yīng)激具有減緩作用[9]；COS對(duì)PBMC抗氧化功能的促進(jìn)作用以及對(duì)炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)生物學(xué)活性的抑制作用呈劑量依賴性，可降低iNOS的含量和基因表達(dá)，進(jìn)而降低NO的生成[10]，但其確切機(jī)制尚不清楚。iNOS在正常細(xì)胞中表達(dá)量極少，但在IL-1β等炎癥因子刺激下持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而使NO過(guò)量生成，因此使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[11]。白細(xì)胞介素-1(IL-1)是多種器官炎癥和組織損傷的重要介導(dǎo)劑，IL-1家族主要由2種刺激劑[白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β]、2種受體[Ⅰ型白細(xì)胞介素-1受體(IL-1RⅠ)、Ⅱ型白細(xì)胞介素-1受體(IL-1RⅡ)]以及1種特異性受體拮抗劑[白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)]組成[12]。當(dāng)IL-1α或IL-1β與白細(xì)胞介素-1受體(IL-1R)結(jié)合可以激活相關(guān)信號(hào)通路。LPS是一種來(lái)源于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，是IL-1β等炎癥介質(zhì)的誘導(dǎo)劑[13]。研究表明，由LPS引起的小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)注射IL-1ra進(jìn)行治療，成功減少了IL-1β表達(dá)，進(jìn)而顯著降低了炎癥反應(yīng)[14]。Pang等[15]的研究也表明，0.1 mg/kg的IL-1ra可以顯著減少由LPS誘導(dǎo)的成年大鼠的炎癥反應(yīng)。這些研究結(jié)果說(shuō)明IL-1ra可以通過(guò)阻斷IL-1信號(hào)通路保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。因此推斷COS對(duì)PBMC氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用可能與其降低了IL-1β的表達(dá)進(jìn)而降低了NO的生成有關(guān)，但確切研究尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步探究COS減緩奶牛PBMC氧化損傷機(jī)制是否與IL-1β有關(guān)，本文以LPS作為外源誘導(dǎo)劑，刺激細(xì)胞氧化應(yīng)激，以IL-1ra阻斷IL-1β的生物學(xué)活性，探討COS對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛PBMC氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PBMC通過(guò)采集奶牛外周血分離培養(yǎng)制備；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；COS購(gòu)自濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，脫乙酰度90.27%，相對(duì)分子質(zhì)量<3 000；IL-1ra(貨號(hào)AF-480-SP)購(gòu)自RD公司；臺(tái)盼藍(lán)、牛PBMC分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.2 試劑配制

LPS工作液的配制方法：取1 mg LPS粉末溶于1 mL超純水中，配制成濃度為1 mg/mL的LPS一級(jí)母液，繼續(xù)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋10倍配制成濃度為100 μg/mL的LPS二級(jí)母液。試驗(yàn)開始前，吸取1 mL二級(jí)母液溶解于9 mL RPMI-1640培養(yǎng)基配制成終濃度為10 μg/mL的LPS工作液。

IL-1ra工作液的配制方法：取25 μg IL-1ra溶于250 μL高壓超純水中，配制成濃度為100 μg/mL的一級(jí)母液，繼續(xù)按照試驗(yàn)要求用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋一級(jí)母液，配制成終濃度為1 ng/mL的IL-1ra工作液。

COS工作液的配制方法：準(zhǔn)確稱取0.16 g COS溶解于10 mL高壓超純水中，配制成濃度為16 mg/mL的COS一級(jí)母液。將COS一級(jí)母液按照試驗(yàn)要求用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，配制成終濃度為160 μg/mL的COS工作液。

上述LPS、IL-1ra、COS工作液均通過(guò)0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾，并避光保存。

1.3 PBMC的分離與培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用單次密度梯度離心分離法培養(yǎng)PBMC，分離培養(yǎng)方法參照鄭亞光等[9]報(bào)道的方法進(jìn)行。對(duì)健康奶牛尾靜脈采血后12 h內(nèi)進(jìn)行PBMC分離，簡(jiǎn)要步驟如下：將血液樣本緩慢加入到盛有牛PBMC分離液的離心管中，血液在上方，血液與分離液比例為1∶1，400×g離心40 min(離心機(jī)溫度要低于25 ℃，細(xì)胞獲得率高低與室溫有關(guān)，超過(guò)25 ℃時(shí)細(xì)胞獲得率降低)，離心后由上至下分為4層，依次為血漿層、環(huán)狀乳白色PBMC層、透明分離液層和紅細(xì)胞層。吸取PBMC層，并用PBS重懸清洗細(xì)胞，250×g離心10 min后棄上清，重復(fù)清洗細(xì)胞2次后，將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)68 h后將250×g離心15 min后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h取部分細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將上述分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個(gè)/mL的密度接種于24孔板中，并隨機(jī)分為8個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)。第1組為對(duì)照組(CON組，-COS-IL-1ra-LPS)，利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h；第2組為COS組(+COS-IL-1ra-LPS)，利用只含COS、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞72 h；第3組為L(zhǎng)PS組(-COS-IL-1ra+LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h；第4組IL-1ra組(-COS+IL-1ra-LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞42 h，后添加IL-1ra工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞30 h；第5組COS+IL-1ra組(+COS+IL-1ra-LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞42 h，后添加IL-1ra工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞30 h；第6組COS+LPS組(+COS-IL-1ra+LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h；第7組IL-1ra+LPS組(-COS+IL-1ra+LPS)，先利用不含LPS、COS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞42 h，后添加IL-1ra工作液培養(yǎng)細(xì)胞6 h，最后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h；第8組COS+IL-1ra+LPS組(+COS+IL-1ra+LPS)，先利用只含COS工作液、不含LPS和IL-1ra工作液的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞42 h，后添加IL-1ra工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6 h，最后添加LPS工作液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見圖1。COS、LPS和IL-1ra工作液濃度參照本課題組前期研究結(jié)果分別確定為160 μg/mL、10 μg/mL和1 ng/mL，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；IL-1ra：白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑 interleukin-1 receptor antagonist；COS：殼寡糖 chitosan。

1.5 樣品采集與處理

細(xì)胞培養(yǎng)液：將分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板中(200 μL/孔)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求處理結(jié)束后，反復(fù)吹打混勻每組的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別收集到1.5 mL Eppendorf離心管中，4 ℃、1 000×g離心10 min，收集上清液用于NO、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量與iNOS、活性氧簇(ROS)、硫氧化蛋白還原酶(TrxR)活性和T-AOC的測(cè)定。

細(xì)胞裂解液：將分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個(gè)/mL的密度接種于24孔板中(1.5 mL/孔)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求處理結(jié)束后，反復(fù)吹打混勻收集細(xì)胞懸浮液到1.5 mL Eppendorf離心管中，加1 mL PBS清洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，置于4 ℃冰箱中裂解30 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液于新的離心管中，用于T-SOD、GPx、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量的測(cè)定。

細(xì)胞RNA提取樣品：將分離培養(yǎng)得到的PBMC以6×106個(gè)/mL的密度接種于24孔板中(1.5 mL/孔)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求處理結(jié)束后，反復(fù)吹打混勻收集細(xì)胞懸浮液到1.5 mL Eppendorf離心管中，250×g離心10 min后棄上清，加1 mL PBS重懸細(xì)胞，離心棄上清，清洗2遍，加1 mL Trizol Plus于冰上反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，用于后續(xù)RNA提取。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 抗氧化指標(biāo)、iNOS與ROS活性以及NO與炎癥因子含量

T-SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定、CAT活性采用比色法測(cè)定、GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定，T-AOC采用鉬酸銨顯色法測(cè)定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量與iNOS、ROS、TrxR活性均采用雙抗體夾心法測(cè)定，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒均購(gòu)自R&D公司。

1.6.2 抗氧化酶、炎癥因子及核因子-κB(NF-κB)p65和核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量

抗氧化酶TrxR和GPx1，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS及Nrf2、NF-κBp65的mRNA相對(duì)表達(dá)量采用TB Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。以18S、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，對(duì)RT-qPCR的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用2-△△Ct計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序?qū)λ刑幚磉M(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較(Duncan氏法)。以P≤0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抗氧化指標(biāo)、iNOS與ROS活性以及NO與炎癥因子含量

由表1可知，與CON組相比，PBMC的GPx、T-SOD、CAT和TrxR活性及T-AOC在LPS組均顯著降低(P≤0.05)，而在COS組、COS+IL-1ra組均顯著升高(P≤0.05)，但COS組與COS+IL-1ra組、IL-1ra組與CON組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS組和COS+LPS組的上述抗氧化指標(biāo)均顯著升高(P≤0.05)，但這些指標(biāo)在IL-1ra+LPS組與COS+LPS組、COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 COS和IL-1ra對(duì)LPS損傷的PBMC抗氧化酶指標(biāo)、iNOS與ROS活性以及炎癥因子與NO含量的影響Table 1 Effects of COS and IL-1ra on antioxidant indexes, iNOS and ROS activities， inflammatory factors and NO contents in PBMC damaged by LPS

炎癥因子含量與上述抗氧化指標(biāo)的變化規(guī)律呈相反的趨勢(shì)。與CON組相比，LPS組的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P≤0.05)，COS組與IL-1ra組間上述指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS和COS+LPS組的上述指標(biāo)均顯著降低(P≤0.05)，但I(xiàn)L-1ra+LPS組與COS+LPS組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra組與IL-1ra組相比，COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，上述指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。MDA和NO含量、iNOS和ROS活性的變化趨勢(shì)與上述指標(biāo)呈相似的變化規(guī)律。

2.2 抗氧化酶、炎癥因子及NF-κB p65和Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量

由表2可知，與CON組相比，COS組GPx1和TrxR的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P≤0.05)，LPS組則顯著降低(P≤0.05)，而IL-1ra組與CON組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS組和COS+LPS組GPx1和TrxR的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P≤0.05)，而IL-1ra+LPS組與COS+LPS組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，上述基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，LPS組Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P≤0.05)，但COS組、IL-1ra組無(wú)顯著變化(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra+LPS組和COS+LPS組Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P≤0.05)，而IL-1ra+LPS組較COS+LPS組顯著降低(P≤0.05)。COS+IL-1ra組與IL-1ra組相比，Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P≤0.05)。

表2 COS和IL-1ra對(duì)LPS損傷的PBMC抗氧化酶、炎癥因子、NF-κB p65和Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Table 2 Effects of COS and IL-1ra on mRNA relative expression levels of antioxidant enzymes, inflammatory factors, NF-κB p65 and Nrf2 in PBMC damaged by LPS

炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA相對(duì)表達(dá)量與抗氧化酶呈相反的變化規(guī)律。與CON組相比，LPS組IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P≤0.05)，但COS組、IL-1ra組無(wú)顯著變化(P>0.05)。與LPS組相比，IL-1ra +LPS組、COS+LPS組上述基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P≤0.05)，但I(xiàn)L-1ra+LPS組與COS+LPS組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。COS+IL-1ra組與IL-1ra組相比，COS+IL-1ra+LPS組與COS+LPS組相比，上述指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。NF-κBp65的mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化與上述炎癥因子呈相似的變化規(guī)律。

3 討 論

3.1 COS對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛PBMC氧化應(yīng)激損傷具有減緩作用

抗氧化酶活性和炎癥因子含量的變化是反映細(xì)胞是否受到氧化損傷的重要指標(biāo)[16]。在一定范圍內(nèi)，抗氧化酶活性越高，說(shuō)明機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)；炎癥因子含量在一定范圍內(nèi)升高，免疫功能增強(qiáng)，但過(guò)度升高則表現(xiàn)為免疫功能紊亂，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。LPS是一種來(lái)源于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，是IL-1β等炎癥介質(zhì)的誘導(dǎo)劑，例如，LPS會(huì)誘導(dǎo)鼠產(chǎn)生炎癥因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激[13]。IL-1β等炎癥因子也刺激細(xì)胞中iNOS持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而使NO過(guò)量生成，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[11]。研究表明，LPS可刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞中IL-1β含量顯著增加，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[17]。因此本試驗(yàn)利用LPS在體外損傷模型中誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生。COS是自然界中唯一天然存在的帶正電荷的堿性多糖，并因其強(qiáng)大的抗氧化能力可以作為天然的抗氧化劑。研究表明，給大鼠飼喂COS可以通過(guò)顯著提高抗氧化酶活性減緩由LPS引起的氧化損傷[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)了IL-1β等炎癥因子的釋放，引起iNOS的表達(dá)與NO含量的升高，因此降低了抗氧化酶的活性，升高了MDA含量，誘導(dǎo)了奶牛PBMC的氧化應(yīng)激；COS逆轉(zhuǎn)了LPS引起的抗氧化酶活性及其基因表達(dá)的降低，即COS對(duì)LPS引起的奶牛PBMC氧化應(yīng)激損傷具有緩解作用。

3.2 COS通過(guò)抑制IL-1β的生物學(xué)活性減緩LPS誘導(dǎo)的奶牛PBMC氧化應(yīng)激損傷

IL-1是典型的促炎細(xì)胞因子，在先天免疫反應(yīng)中起著重要作用，參與一些炎性疾病的發(fā)病機(jī)制[19]。在機(jī)體處于健康狀態(tài)下，IL-1在血液?jiǎn)魏思?xì)胞中的含量很低或者不存在，但在疾病狀態(tài)下其含量顯著增加[20]。IL-1β是IL-1家族重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)刺激iNOS的基因和蛋白大量表達(dá)，進(jìn)而催化生成過(guò)量的NO[11]。IL-1β主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，還可以由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，可以被IL-1ra所拮抗[21]。IL-1ra已在臨床醫(yī)學(xué)上廣泛用于治療多種自發(fā)性免疫性疾病[12]。IL-1ra是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的特異性抑制劑，它不能直接與IL-1結(jié)合，而是通過(guò)與IL-1R結(jié)合后具有很強(qiáng)的親和力，從而無(wú)法激活細(xì)胞活性，抑制IL-1的生物學(xué)活性[12]。本研究表明，IL-1ra單獨(dú)處理PBMC并未對(duì)細(xì)胞的抗氧化酶活性和炎癥因子含量產(chǎn)生顯著影響，說(shuō)明其對(duì)PBMC沒有副作用。IL-1ra作為炎癥因子的受體拮抗劑，對(duì)新生大鼠由LPS引起的氧化應(yīng)激和促炎效應(yīng)有保護(hù)作用[14]。LPS可誘導(dǎo)PBMC發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)氧化還原遭到破壞，而抑制IL-1β的生物學(xué)活性對(duì)減緩細(xì)胞氧化損傷至關(guān)重要[4]。本研究得出了類似的結(jié)果，結(jié)果顯示，單一添加LPS誘導(dǎo)了IL-1β產(chǎn)生，引起iNOS活性以及NO含量升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，降低了抗氧化酶GPx、TrxR、SOD和CAT的活性及GPx1、TrxR的表達(dá)；但I(xiàn)L-1ra+LPS處理逆轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)的變化，減緩了細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)一步說(shuō)明了IL-1β是LPS誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因素；與LPS處理相比，COS+LPS處理降低了IL-1β、NO含量以及iNOS活性，升高了抗氧化酶GPx、TrxR、SOD和CAT的活性及GPx1、TrxR的表達(dá)量，緩解了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，說(shuō)明COS處理與IL-1ra處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷具有相似的預(yù)保護(hù)作用。因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步得出，COS通過(guò)抑制IL-1β的生物學(xué)活性對(duì)LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮預(yù)保護(hù)作用，進(jìn)而減緩了氧化應(yīng)激的發(fā)生。

研究指出，誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的活化可以促進(jìn)下游基因iNOS以及炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致NO等自由基大量釋放[10]。COS可以顯著抑制MIN6細(xì)胞中NF-κBp65的基因與蛋白的表達(dá)，降低iNOS的活性及其基因表達(dá)，抑制NO的生成[22]。在人乳腺癌細(xì)胞中的研究表明，GPx1可以抑制NF-κB的上游激酶核因子-κB抑制蛋白(IκB)，使NF-κB p65磷酸化[23]。蘇芮[24]研究報(bào)道，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中沉默GPx1基因的表達(dá)，會(huì)激活NF-κB信號(hào)通路，增加下游促炎細(xì)胞因子的活性及基因表達(dá)，刺激iNOS的活性及其基因表達(dá)與NO含量增加，使細(xì)胞抗氧化能力下降。石惠宇等[17]研究表明，通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路可增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞GPx1基因的表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制NF-κB信號(hào)通路的活性。研究表明，激活的Nrf2增加其下游抗氧化系統(tǒng)中GPx、TrxR和SOD等基因表達(dá)，進(jìn)而引起NF-κB信號(hào)通路磷酸化水平的降低，減少了自由基生成并減弱了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度，從而增加細(xì)胞的抗氧化功能[25]。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)奶牛PBMC氧化應(yīng)激的同時(shí)，Nrf2及其靶基因GPx的活性降低，NF-κB p65及其下游炎癥因子IL-1β和iNOS基因的表達(dá)均上調(diào)，當(dāng)添加COS或IL-1ra處理后會(huì)引起了上述指標(biāo)呈相反的變化，提示COS可能通過(guò)上調(diào)Nrf2的活性，增強(qiáng)GPx活性，對(duì)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，減少IL-1β的釋放，進(jìn)而降低NO的生成，減緩細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。COS減緩LPS誘導(dǎo)的奶牛PBMC氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制如圖2所示。然而，目前相關(guān)研究甚少，確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

虛線代表需要進(jìn)一步驗(yàn)證的內(nèi)容?！?”代表促進(jìn)作用，“-”代表抑制作用。The dotted lines represent content that requires further validation.“+” represents promotion, and “-” represents inhibition.

4 結(jié) 論

LPS誘導(dǎo)的奶牛PBMC氧化應(yīng)激引起IL-1β含量增加，COS通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活性來(lái)減少IL-1β的釋放，進(jìn)而降低NO的生成，從而發(fā)揮其減緩氧化應(yīng)激損傷的功能。